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redcoon België GENTAUR BVBA

VAT BE0473327336

Av. de l Armee 68 B4

1040 Brussels BELGIUM

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Fax + 32 16 50 90 45

GENTAUR France SARL

SIRET 48423788800017

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75005 Paris, France

 Tel 01 43 25 01 50

Fax 01 43 25 01 60 

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52074 Aachen, Germany

 Tel 0241 40 08 90 86

Fax 0241 55 91 05 36

GENTAUR Pol Sp. Z.o.o. Ulica Ogarna 15/19B m2

80-826 GDANSK

Tel 00 48 51 760 77 08

Fax: 00 32 16 50 90 45

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23015 Milano, Italy

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Finland Helsset
+358942419041

Ελλάς Αθήνα
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+35316526556
 

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+35220880274
 

Magyarország Budapest
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+31208080893
 

Norge Oslo
+4721031366
 

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+43720880899
 

Sverige Stockholm
+46852503438
 

Schweiz Züri
+41435006251
 

 

Northern America 

Canada Montreal
+15149077481
 

US New York
+17185132983

 

Other Countries redcoon België
0032 (0)16 41 44 07

 

Cardio MPOTM

Enzyme Immunoassay Reagent Kit

Catalog Number: 7601

for the Quantitative Determination of Myeloperoxidase (MPO) in Human Plasma

Use in conjunction with PrognostiX CardioMPO™ Control and Calibrator Kits (Cat.# 8601 and 9601).

FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE

STORE COMPONENTS AT 2 TO 8°C

FOR PROFESSIONAL USE ONLY

Equipo de reactivos para inmunoanálisis enzimático Cardio MPOTM

Número de catálogo: 7601

para la determinación cuantitativa de la mieloperoxidasa (MPO) en plasma humano

Usar con los equipos de controladores y controles CardioMPO™ de PrognostiX (N.º cat. 8601 y 9601).

PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO

CONSERVAR LOS COMPONENTES A 2 A 8 ºC

SÓLO PARA USO POR PROFESIONALES

1

Cardio MPOMC

Kit de réactifs pour dosage immunoenzymatique

Numéro de catalogue : 7601

Pour le dosage quantitatif de la myéloperoxydase (MPO) dans le plasma humain

À utiliser conjointement avec les kits de contrôles et de calibrateurs CardioMPOmc (n° de cat. 8601 et 9601).

POUR USAGE DIAGNOSTIQUE IN VITRO

CONSERVER LES COMPOSANTS ENTRE 2 ET 8 °C

POUR USAGE PROFESSIONNEL UNIQUEMENT

Cardio MPOTM

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

Bestellnummer: 7601

zur Quantitativen Bestimmung von Myeloperoxidase (MPO) in Humanplasma

In Kombination mit PrognostiX CardioMPO™ Kontroll- und Kalibrator-Kits (Best. Nr. 8601 und 9601) verwenden.

ZUM GEBRAUCH IN DER IN-VITRO-DIAGNOSTIK

KITKOMPONENTEN BEI 2 BIS 8°C LAGERN

NUR FÜR DEN PROFESSIONELLEN GEBRAUCH

2

Cardio MPOTM

Kit di Reagenti per Saggio Immunoenzimatico

Numero di catalogo: 7601

per la determinazione quantitativa della mieloperossidasi (MPO) in plasma umano

Da utilizzare insieme ai kit di controllo e di calibrazione CardioMPO™ PrognostiX (Cat. N. 8601 e 9601)

PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO

CONSERVARE I COMPONENTI A 2 – 8° C

SOLTANTO PER USO DI TIPO PROFESSIONALE 3

Cardio MPOTM

Enzyme Immunoassay Reagent Kit

INTENDED USE

The CardioMPO™ Reagent Kit is an enzyme immunoassay intended for the quantitative determination of myeloperoxidase in human plasma, to be used in conjunction with clinical history, ECG and cardiac biomarkers to evaluate patients presenting with chest pain that are at risk for major adverse cardiac events, including myocardial infarction, need for revascularization, or death.

SUMMARY AND EXPLANATION

The activation of leukocytes prompts the secretion of MPO and the generation of oxidants.1 Several lines of evidence suggest that the enzyme myeloperoxidase (MPO), secreted by the leukocytes, participates in atherosclerotic progression and contributes to plaque vulnerability.2,3 MPO has been linked to the development of lipid-laden soft plaque, the activation of protease cascades affecting the stability and thrombogenicity of plaque, the production of cytotoxic and prothrombogenic oxidized lipids, and the consumption of nitric oxide, leading to vasoconstriction.3

The plasma MPO concentration in patient samples acquired during the period of assessment for acute coronary syndrome in the Emergency Department predicts the risk of major adverse cardiac events (MACE); i.e. myocardial infarction, need for revascularization or death, over the next 30-day and 6-month interval.2 The odds ratio for MACE increases with increasing levels of plasma MPO in all quartiles of the population. The predictive power of the MPO concentration is independent of age, gender, race, CRP level, Troponin T level, CK-MB level, history of diabetes, history of smoking, history of hyperlipidemia, and history of hypertension.

PRINCIPLE OF THE TEST

The CardioMPO™ Reagent Kit is a sandwich enzyme immunoassay test4 for the measurement of MPO concentration in human plasma. The CardioMPO™ Control Kit and CardioMPO™ Calibrator Kit are for use with the CardioMPO™ Reagent Kit, but are provided separately to facilitate more efficient packaging and handling.

The CardioMPO™ Calibrator Kit contains 5 Calibrators (A-E) for use with the CardioMPO™ Reagent Kit. Actual Calibrator values are provided on individual Calibrator labels. Calibrators are provided ready-to-use.

The CardioMPO™ Control Kit contains 3 Controls (1-3) also for use with the CardioMPO™ Reagent Kit. Actual Control concentration ranges are provided on individual Control labels. Controls are treated in the same manner as patient samples.

4

Calibrators are added directly to the appropriate wells of the Microtiter Plate. Assay Buffer is added to all wells that are intended for Control or sample analysis. Aliquots of Controls or samples are added to the appropriate wells and the plate is incubated for 45 minutes at 20-26°C. The wells are then washed with Wash Buffer to remove antigens not specifically bound to the immobilized antibody.

An anti-MPO monoclonal antibody labeled with the enzyme horseradish peroxidase (HRP) is then added to each well and incubated for 45 minutes at 20-26°C. This conjugated antibody binds to the MPO captured on the plate, and the MPO in the sample is “sandwiched” between the antibody on the solid phase and the antibody conjugate. The plate is again washed with Wash Buffer to remove unbound HRP-labeled antibody.

The substrate, tetramethylbenzidine (TMB), is then added to each well and incubated for 15 minutes at 20-26°C resulting in the development of a blue color. Color development is stopped with the addition of Stop Solution, changing the color to yellow.

The enzymatic turnover of the substrate is determined spectrophotometrically at 450 nm, preferably with correction at 630 nm, and is directly proportional to the concentration of MPO. The absorbances of the Calibrators are used to plot a calibration curve of absorbance versus MPO concentration from which the MPO concentration in the Controls or samples can be determined.

REAGENTS AND MATERIALS

Materials supplied with the kit:

Microtiter Plate, Coated with Anti-MPO Antibody, 96-Well Plate

Microtiter plate coated with a mouse monoclonal antibody specific to MPO, 12x8-well strips.

Assay Buffer, 100 mL

Citrate buffered saline containing detergents and additives.

Anti-MPO Antibody Conjugate, 13 mL, Yellow color

Yellow solution of a mouse monoclonal antibody specific to MPO conjugated to HRP.

TMB Substrate Reagent, 13 mL

Solution of 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide. PROTECT FROM PROLONGED EXPOSURE TO LIGHT

Stop Solution, 13 mL

Solution of sulfuric acid (0.4N) in water. Keep tightly capped.

CAUTION: IRRITANT

25X Wash Buffer Concentrate, 40 mL

Tris-buffered saline containing detergents.

Plate Sealer, 2

Pouch Sealer, 1

5

Materials required but not provided:

CardioMPO™ Calibrator Kit, 5 MPO Levels (A-E), 1.1 mL each Cat. Number 9601

MPO in phosphate buffer with proteins, detergents, and stabilizers. Check individual Calibrator labels for actual concentrations.

CardioMPO™ Control Kit, 3 MPO Levels (1-3), 0.5 mL each Cat. Number 8601

MPO in human lithium heparin plasma. Check individual Control labels for actual concentration ranges. CAUTION: CONTAINS HUMAN SOURCE MATERIAL. TREAT AS POTENTIALLY INFECTIOUS.

Precision single- and multi-channel pipettors for volumes between 10 μL and 1000 μL with disposable polypropylene pipet tips

Type I Deionized or Distilled water

Graduated cylinders

Vortex mixer or equivalent

Orbital microplate shaker capable of running at 500 rpm

Absorbent paper towels

Microplate washer

A microplate reader capable of reading at 450 nm, preferably with correction at 630 nm

Computer software capable of appropriate curve fit for calculating concentration of MPO from the optical density of Calibrators (optional).

Graph paper for manual data reduction (optional).

WARNINGS AND PRECAUTIONS

For In Vitro Diagnostic Use.

For Professional Use Only.

All plasma samples should be treated as potentially biohazardous material.

Proper handling and disposal methods should be followed in accordance with local, state, and federal regulations.

TMB Substrate Reagent contains 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB). If exposed on skin, immediately flush area with soap and water. If eyes are exposed, flush with copious amounts of water and seek immediate medical attention.

Stop Solution contains 0.4N sulfuric acid. If exposed on skin, immediately flush area with soap and water. If eyes are exposed, flush with copious amounts of water and seek immediate medical attention.

Do not use reagents past their expiration dates.

Do not reuse microtiter wells.

Do not mix components from other lots of CardioMPO™ Reagent Kits.

6

Controls are not provided with the kit but may be purchased separately (Cat. No. 8601). Include the CardioMPO™ Controls in each patient run. If Control values are not within acceptable limits, the assay should be repeated.

REAGENT STORAGE

Unopened test kits should be stored refrigerated (2-8 °C) upon receipt and until the expiration date. Unused microtiter stripwells should be stored sealed in the foil pouch with desiccant at 2-8 °C. When stored as directed, unopened test kits will remain stable until the expiration date indicated on the label. Do not use any reagents that show indications of discoloration, cloudiness, precipitation, or leakage.

SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE

Blood samples should be collected in lithium heparin collection tubes using aseptic venipuncture technique. Samples should be thoroughly mixed by inversion to ensure accurate results. Lithium heparin samples should be placed on ice or at 2-8 °C immediately and stored at 2-8 °C until separation. Plasma should be separated from the cells using a standard separation procedure, preferably in a refrigerated centrifuge. A maximum of two hours from the time of collection is recommended by NCCLS guidelines.5 Separated plasma should remain at 20-26°C for no longer than 8 hours. If assays will not be completed within eight hours, plasma should be refrigerated (2 to 8°C). CardioMPO™ levels in plasma have been shown to be stable for 8 days at 2-8°C. If assays are not completed within 8 days or the separated plasma is to be stored beyond 8 days, plasma should be stored frozen at or below -15°C. Plasma samples are not to be repeatedly frozen and thawed, since this can cause analyte deterioration. CardioMPO™ levels in plasma have been shown to be stable through 2 freeze / thaw cycles.

ASSAY PROCEDURE

Procedural Notes

1. Allow reagents, samples, Calibrators and Controls to warm to room temperature (20–26°C) for at least 30 minutes before use.

2. Vortex the samples, Calibrators, and Controls to mix thoroughly. Avoid foaming.

3. Remove the stripwell frame and required number of coated microtiter strips from the foil pouch after bringing the plate to room temperature (20–26°C). Place any unused stripwells in the foil pouch with the enclosed desiccant, reseal, and store at 2-8ºC.

4. Use a new polypropylene pipette tip for each reagent, Calibrator, Control, or sample to prevent contamination.

5. All Calibrators, Controls, and samples should be run in duplicate.

6. Prior to the addition of Anti-MPO Antibody Conjugate and TMB Substrate Reagent, ensure that there is no residual Wash Buffer in the wells. Any remaining Wash Buffer may cause variation in test results.

7

7. For accurate measurement, the addition of samples, Calibrators, and Controls must be precise. Pipet carefully using only calibrated equipment.

8. All kit components, except Wash Buffer Concentrate, are supplied ready to use. Refer to the following procedure for preparing Working Wash Buffer solution.

1X Working Wash Buffer Preparation

Allow Wash Buffer Concentrate to come to room temperature (20–26°C) prior to use. Prepare 1X Working Wash Buffer by pouring a bottle of the provided 25X Wash Buffer Concentrate into a clean one liter vessel. Rinse the bottle with Type I deionized water to remove residual buffer and dissolve crystals. Add the rinse, dilute with Type I deionized water to a total volume of 1.0 liter and mix thoroughly. When stored at 2-8°C, 1X Working Wash Buffer is stable for up to two months.

Plate Preparation

1. Pipette 100 μL of each CardioMPO™ Calibrator into the appropriate wells of the coated Microtiter Plate.

2. Pipette 90 μL of Assay Buffer into the appropriate wells of the coated Microtiter Plate intended for samples and Controls.

3. Pipette 10 μL of well-mixed samples and Controls into the appropriate wells.

Sample Incubation

1. Seal the plate with the provided plate sealer and incubate on a plate shaker set at 500 rpm for 45 minutes at room temperature (20-26°C).

2. At the end of the incubation period, wash the microtiter wells four times with 400 μL of Working Wash Buffer. After the final wash, aspirate the wells.

3. Blot the plate on absorbent paper towels after the final wash to remove any remaining Wash Buffer. Do not allow wells to dry. Proceed immediately to next step.

Antibody Conjugate Incubation

1. Pipette 100 μL of Anti-MPO Antibody Conjugate into each well.

2. Seal the plate with the provided plate sealer and incubate on a plate shaker set at 500 rpm for 45 minutes at room temperature (20-26°C).

3. At the end of the incubation period, wash the microtiter wells four times with 400 μL of Working Wash Buffer. After the final wash, aspirate the wells.

4. Blot the plate on absorbent paper towels after the final wash to remove any remaining Wash Buffer. Do not allow wells to dry. Proceed immediately to next step.

8

Substrate Incubation and Color Development

1. Pipette 100 μL of TMB Substrate Reagent into each well.

2. Incubate on a plate shaker at 500 rpm for 15 minutes at room temperature (20-26°C).

Stop and Reading

1. Stop the reaction by adding 100 μL of Stop Solution to each well.

2. Gently swirl the plate on a flat surface to mix. Ensure that the blue color has completely changed to yellow.

3. Read the optical density at 450 nm using a microtiter plate reader. Background correction at 630 nm is recommended.

CALCULATION OF RESULTS

1. Construct a calibration curve using appropriate computer software. A four-parameter curve fit is recommended. Manual calculations can be performed by plotting the mean absorbance obtained for each Calibrator on the y-axis versus the MPO concentration (pmol/L) on the x-axis.

2. Using the mean absorbance value for each sample and Control, determine the corresponding concentration of MPO in pmol/L from the calibration curve. The MPO level assigned for each Calibrator reflects the use of the 10 μL sample size (a 1:10 dilution in the plate) so no further calculation is required.

3. Samples with MPO levels exceeding the value of the highest Calibrator may be reported as greater than that level, e.g. > 8000 pmol/L. Further dilution of samples is not recommended.

9

EXAMPLE CALIBRATION CURVE

Results of a typical calibration curve using O.D. readings at 450 nm with correction at 630 nm are shown on the y-axis against MPO concentrations (pmol/L) shown on the x-axis. The user should generate a new calibration curve with each test performed. The following calibration curve is for illustration purposes only.

Calibrator

MPO Level (pmol/L)

Mean Absorbance

(O.D. at 450 nm,

correction at 630 nm)

A

8020

2.630

B

3650

2.000

C

1580

1.108

D

490

0.346

E

0

0.031 Calibration Curve00.511.522.530100020003000400050006000700080009000Concentration (pmol/L)OD

10

LIMITATIONS

Procedure

Reliable and reproducible results will be obtained when the assay procedure is carried out with a complete understanding of the package insert instructions and with adherence to good laboratory practice.

The wash procedures are critical. Insufficient washing will result in poor precision and falsely elevated or depressed absorbance readings.

As with any assay system employing animal antibodies, the possibility exists for interference by heterophilic antibodies, such as human anti-mouse antibodies (HAMA), present in the sample that could cause falsely elevated or depressed values.

Other factors, including technical or procedural errors, may interfere with the CardioMPOTest and may cause erroneous results.

Clinical Interpretation

MPO levels should be interpreted along with clinical findings and other diagnostic tests.

This test is not intended to replace other traditional risk factors identified for coronary heart disease such as ECG, clinical history, markers of myocardial necrosis, etc.

EXPECTED VALUES

Plasma samples from males (n=150) and females (n=150), from a population of apparently healthy blood donors, were evaluated with the CardioMPO™ Test. A two-stage outlier detection scheme, a Box-Cox transformation followed by a robust outlier detection method, was used to eliminate seven outliers.6 Since there was no significant difference between MPO levels by sex, the reference range was estimated from the entire population after adjustment for outliers.

The median MPO level for subjects in the adjusted database was 340 pmol/L and the range of results was 137 to 984 pmol/L. The non-parametric distribution of myeloperoxidase levels in this normal population yields a two-tailed central 95% reference interval, corrected for the influence of outlier rejection, of 156 – 734 pmol/L. However, in this application the more appropriate single-tailed lower 95% reference interval, again corrected for the influence of the outlier rejection method, is < 640 pmol/L.

PERFORMANCE CHARACTERISTICS

Sensitivity

The minimum detection limit, as calculated by interpolation of the mean plus two standard deviations of 26 replicates of the 0 pmol/L MPO Calibrator (E), is 14 pmol/L MPO.

11

Assay Precision

Total and within-run precision were determined by testing 6 Lithium Heparin Plasma Test Samples with MPO concentrations distributed throughout the calibration range of the assay, according to CLSI (formerly NCCLS) guideline EP5-A. These samples were assayed in duplicate, using a single lot of reagents and Calibrators, on two separate plates per day, for twenty days. A new calibration curve was run in duplicate on each plate. The results of the precision study are summarized in the following table.

Table 4: Summary of Precision Study Results

Sample name

Test MPO concentration (pmol/L)

Number of replicates

Total %CV

Within-run %CV

Lithium heparin plasma Sample 1

307

80

10.2%

5.8%

Lithium heparin plasma Sample 2

610

80

5.8%

5.0%

Lithium heparin plasma Sample 3

1285

76*

7.4%

5.7%

Lithium heparin plasma Sample 4

1459

80

8.9%

8.6%

Lithium heparin plasma Sample 5

2745

80

9.0%

9.0%

Lithium heparin plasma Sample 6

4758

80

8.7%

6.4%

Average

8.3%

6.7%

* 1 days worth of data was excluded from analysis due to gross outliers

Linearity

Lithium heparin plasma samples spiked to high MPO levels were intermixed with neat plasma samples with low MPO levels to create 9 MPO concentrations across and exceeding the anticipated linear range. Linearity of the MPO levels measured in the mixtures was assessed using the polynomial evaluation of linearity as recommended in CLSI guideline EP6-A. The CardioMPO™ Test has been demonstrated to be linear from 14 pmol/L to 9410 pmol/L MPO, within 60 pmol/L or 6% in this interval, in lithium heparin plasma.

Spiking recovery

Nine lithium heparin plasma samples were spiked with 497, 1456, and 2851 pmol/L MPO and analyzed for recovery. The percent recovery was calculated by dividing the mean measured MPO concentration of the spiked sample by the expected MPO concentration, where the expected MPO concentration was the sum of the measured MPO concentration in the neat plasma sample and the concentration of the MPO spike. The average recovery of spiked MPO in lithium heparin plasma ranged from 87% to 117% with a mean of 100.7%.

12

Dilution recovery

Nine lithium heparin plasma samples were spiked with 2851 pmol/L MPO and diluted 1:2, 1:4, and 1:8 with Assay Buffer. The percent recovery was calculated by dividing the mean MPO concentration of the pre-diluted sample multiplied by the dilution factor by the mean MPO concentration of the sample with no pre-dilution. The mean recovery of a 1:2 dilution was 113% for lithium heparin plasma, with recoveries ranging from 107% to 117%

The PrognostiX CardioMPO™ Test is formulated to account for matrix effects associated with a 10 μL human plasma sample. PrognostiX does not recommend further dilution of samples. Samples with MPO levels exceeding the value of the highest Calibrator should be reported as greater than that level, e.g. > 8000 pmol/L. However, a 1:2 dilution using polypropylene labware may be run with the understanding that the MPO concentration obtained from that measurement will be ~13% greater than its actual value.

Cross-reactivity

The potential cross-reactants shown in the following table were tested in lithium heparin plasma and Assay Buffer, according to NCCLS guideline EP7-A. All investigated proteins exhibited less than 0.007% cross-reactivity at the high test concentration and less than 1.7% cross-reactivity at the low test concentration when added to a lithium heparin plasma pool.

Substance tested

Concentrations tested (nmol/L)

α-1 antitrypsin, human

1250, 125, 12.5

C-reactive protein, human

543, 54.3, 5.43

Lysozyme, human

4464, 446.4, 44.64

IgA, human

417, 41.7, 4.17

Elastase, human

2500, 250, 25

Eosinophil Peroxidase, human

887, 88.7, 8.87

Lactoperoxidase, bovine

801, 80.1, 8.01

Lactoferrin, human

781, 78.1, 7.81

COX1, ovine

893, 89.3, 8.93

COX2, human

868, 86.8, 8.68

Thyroid peroxidase, human

595, 59.5, 5.95

Troponin I, human

2155, 215.5, 21.55

13

Interfering Substances

The substances shown in the following table, when tested in plasma containing 3000 pmol/L and 1000 pmol/L MPO according to NCCLS guideline EP7-A, were found not to interfere up to the concentrations indicated. Bias of 10% or less was not considered interference.

Substance tested

Test concentration (mg/L)

Comments

Acetylsalicylic acid

600

Toxic dose

Albumin

50000

High*

Amoxicillin

75

3x therapeutic dose

Bilirubin, conjugated

50

High*

Bilirubin, unconjugated

150

High*

Captopril

5

Toxic dose

Ceruloplamin

600

High

Cholesterol

1000

High*

DNA

16.7

High

Fenofibrate

45

3x therapeutic dose

Hemoglobin

5000

Hemolysis*

Heparin, lithium

3000 U/L

3x therapeutic dose

Hydrochlorothiazide

6

3x therapeutic dose

Hydrocortisone

0.69

Toxic dose

Ibuprofen

500

Toxic dose

Indomethacin

36

2x therapeutic dose

Isosorbide dinitrate

0.15

3x therapeutic dose

Lovastatin

53

2x therapeutic dose

Methotrexate

160

Therapeutic dose

Metoprolol

5

Toxic dose

Naproxen

500

4x therapeutic dose

Niacin

0.5

5x therapeutic dose

Nifedipine

0.4

2x therapeutic dose

Salicylic acid

600

Toxic dose

Sodium azide

0.50%

5x preservative dose

Triglycerides

5000

Lipemia

* High level of interfering substance per NCCLS EP7-A

Hook

There is no evidence of hook effect up to 1 μmol/L MPO, roughly 100 times greater than the upper end of the reportable range and 600 times greater than the median level of patients in the clinical study, in the CardioMPO™ Test.

14

Interfering Antibodies

Twenty samples known to contain elevated levels of HAMA or RF were analyzed for interference in the CardioMPOTest. The mean recovery of MPO in these samples was 100% with individual recoveries ranging from 96% to 109%. Ten samples known to contain anti-MPO p-ANCA antibodies showed a mean recovery of 40% with individual recoveries ranging from 37% to 43%. Therefore, no evidence of significant interference was observed due to HAMA or RF; however, apparent MPO levels may be decreased in the presence of anti-MPO p-ANCA antibodies.

CLINICAL STUDY

To determine the efficacy of the PrognostiX CardioMPO™ Test as a predictor of risk for major adverse cardiac events, MPO levels were measured in 560 banked plasma samples from a study of patients presenting to the Emergency Department within 24 hours of the onset of chest pain.2 Participants were followed for the development of myocardial infarction, need for revascularization (coronary artery bypass surgery, percutaneous coronary intervention or catheterization with stenosis in at least two major coronary vessels of more than 70%), or death over the next 6 months. Samples assayed with the CardioMPO™ Test were from patients aged 23 to 96 years, with a median age of 64. Clinical diagnosis was established as described previously.7 The incidence of major adverse cardiac events was assessed by follow-up phone calls at 30 days and 6 months.

Multivariate logistic-regression models (SAS version 8.0, SAS Institute) were developed to calculate odds ratios and 95% confidence intervals. The adjusted covariates were age, gender, race, Troponin T (≤0.03 ng/mL vs. >0.03 ng/mL)7, C-reactive Protein (<1 mg/L, 1-3 mg/L, >3 mg/L)2, CK-MB (≤8.8 ng/mL vs. >8.8 ng/mL)7, history of smoking, history of diabetes, history of hypertension, and history of high cholesterol. Missing covariate information on some subjects reduced the study population. The risk of MACE in all patients in the ensuing 30-day period increased with increasing quartiles of myeloperoxidase levels.

Similar analysis of patients that were persistently negative for Troponin T (≤0.03 ng/mL) also revealed a significantly higher risk of MACE for patients with plasma MPO levels in higher quartiles. Adjusted odds ratios and the percentage of patients within an MPO quartile with and without MACE at 30 days are shown in the following graphs and tables.

15

Risk of MACE in All Patients 0102030405060708090100<11511151-18791880-2953>2953MPO by Quartile (pmol/L)Patients within Quartile (%)MACENo MACE

MACE at 30 days, All Patients (n=523)

MPO (pmol/L)

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

Odds Ratio

1.0

2.5

2.8

3.3

95% CI

NA

1.3-4.8

1.5-5.6

1.7- 6.4

p value

p = 0.007

p = 0.0021

p < 0.001

*In each analysis the first quartile served as the reference group

Risk of MACE in Patients Persistently Negative for Troponin T 0102030405060708090100<11511151-18791880-2953>2953MPO by Quartile (pmol/L)Patients within Quartile (%)MACENo MACE

MACE at 30 days, TnT negative Patients (n=304)

MPO (pmol/L)

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

Odds Ratio

1.0

3.4

4.1

6.9

95% CI

NA

1.2-9.4

1.5-11.4

2.5-19.2

p value

p = 0.0194

p =0.007

p < 0.001

*In each analysis the first quartile served as the reference group

It should be noted that different cut-off points may be appropriate for different clinical populations.

16

REFERENCES

1. Klebanoff SJ, et al. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brennan ML, et al. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

3. Hazen, SL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004: 24(7): 1143-1146.

4. Engvall E, Perlman P. Immunochemistry, 1971 8(9): 871-874.

5. CLSI (formerly NCCLS). CLSI Document H18-A2 1999 CLSI Wayne, PA.

6. Horn, et al. Clinical Chemistry 2001; 47/12: 2137-2145.

7. McErlean, ES, et al. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

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CardioMPO™ is a pending trademark of PrognostiX, Inc.

17

CardioMPO

Enzyme Immunoassay Reagent Kit

Catalog Number: 7501

PROGNOSTIX CardioMPOReady Reference Guide

1. Allow all reagents, Calibrators, Controls, and patient samples to warm to room temperature (20-26°C) for at least 30 minutes prior to use.

2. Vortex Calibrators, Controls, and samples to mix thoroughly.

3. Pipet 100 μL of each of the CardioMPO™ Calibrators into appropriate microtiter wells.

4. Pipet 90 μL of Assay Buffer into all sample and Control microtiter wells.

5. Pipet 10 μL of patient sample or CardioMPO™ Controls into appropriate microtiter wells.

6. Seal and incubate for 45 minutes, rotating at 500 rpm.

7. Wash 4 times with 400 μL Working Wash Buffer and blot to remove excess buffer.

8. Add 100 μL Anti-MPO Antibody Conjugate (yellow) to each well.

9. Seal and incubate 45 minutes, rotating at 500 rpm.

10. Wash 4 times with 400 μL Working Wash Buffer and blot to remove excess buffer.

11. Add 100 μL TMB Substrate Reagent to each well.

12. Incubate 15 minutes, rotating at 500 rpm.

13. Add 100 μL Stop Solution to each well and swirl to mix.

14. Read the absorbance at 450 nm, preferably with correction at 630 nm.

PROGNOSTIX CardioMPO™ Recommended Microtiter Plate Map

Calibrators and Controls may need to be positioned differently based on the number of samples assayed.

1

2

3

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5

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7

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CAL A

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CTL3

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CAL B

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CTL3

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CAL C

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CTL1

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CAL D

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CTL1

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CAL A

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CAL B

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CAL C

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CTL2

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CAL E

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Equipo de reactivos para inmunoanálisis enzimático Cardio MPOTM

INDICACIONES DE USO

El equipo de reactivos CardioMPO™ es un inmunoanálisis enzimático indicado para la determinación cuantitativa de la mieloperoxidasa en plasma humano, para usarse con el historial clínico, el electrocardiograma y los biomarcadores cardíacos, a fin de evaluar a los pacientes que presentan dolor precordial con riesgo de sufrir episodios cardíacos mayores, como infarto de miocardio, necesidad de revascularización o muerte.

RESUMEN Y EXPLICACIÓN

La activación de los leucocitos induce la secreción de mieloperoxidasa y la generación de oxidantes.1 Varias líneas de pruebas clínicas sugieren que la enzima mieloperoxidasa (MPO), secretada por los leucocitos, participa en la progresión aterosclerótica y contribuye a la vulnerabilidad de las placas.2,3 Se ha vinculado la MPO con la aparición de placas blandas cargadas de lípidos, la activación de cascadas de proteasas que afectan a la estabilidad y la trombogenia de la placa, la producción de lípidos oxidados citotóxicos y protrombógenos, y el consumo de óxido nítrico, que lleva a la vasoconstricción.3

La concentración plasmática de MPO en las muestras de pacientes adquiridas en el período de evaluación de un síndrome coronario agudo en el servicio de urgencias predice el riesgo de episodios cardíacos adversos mayores (ECAM), es decir, infarto de miocardio, necesidad de revascularización o muerte, en el siguiente intervalo de 30 días y de seis meses.2 La razón de posibilidades de las ECAM aumenta al aumentar las concentraciones plasmáticas de mieloperoxidasa en todos los cuartiles de la población. El poder predictivo de la concentración de MPO depende de la edad, el sexo, la raza, la concentración de CRP, la concentración de troponina T, la concentración de CK-MB, y los antecedentes de diabetes, tabaquismo, hiperlipidemia e hipertensión.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

El equipo de reactivos CardioMPO™ es una prueba de inmunoanálisis enzimático en “sándwich” 4 para la determinación de la concentración de mieloperoxidasa en plasma humano. El equipo de controles CardioMPO™ y el equipo de calibradores CardioMPO™ se emplean con el equipo de reactivos CardioMPO™, pero se suministran por separado a fin de facilitar un envasado y manipulación más eficaces.

El equipo de calibradores CardioMPO™ incluye cinco calibradores (A-E) para usar con el equipo de reactivos CardioMPO™. Los valores reales del calibrador se proporcionan en la etiqueta de cada uno de los calibradores. Los calibradores se entregan listos para usar.

19

El equipo de controles CardioMPO™ incluye tres controles (1 a 3) para usar también con el equipo de reactivos CardioMPO™. Las concentraciones reales de los controles se indica en la etiqueta de cada uno de los viales. Los controles se tratan de la misma manera que las muestras de los pacientes.

Los calibradores se añaden directamente a los pocillos correctos de la microplaca de titulación. La solución amortiguadora del análisis se añade a todos los pocillos indicados para el análisis de los controles o de la muestra. Se añaden alícuotas de control o muestra a los pocillos correspondientes y la placa se incuba durante 45 minutos a una temperatura de 20 a 26 ºC. A continuación, los pocillos se lavan con solución amortiguadora de lavado, para eliminar los antígenos que no se hayan unido específicamente al anticuerpo inmovilizado.

Luego, se añade a cada pocillo anticuerpo monoclonal anti-MPO, marcado con la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incuba durante 45 minutos a una temperatura de 20 a 26 °C. Este anticuerpo conjugado se fija a la MPO capturada en la placa, y se forma un "sándwich" con la MPO presente en la muestra, entre el anticuerpo de la fase sólida y el conjugado de anticuerpo. La placa se vuelve a lavar con solución amortiguadora de lavado para eliminar el anticuerpo marcado con HRP que se haya unido.

Seguidamente, se añade a cada pocillo el sustrato, tetrametilbenzidina (TMB), y se incuba durante 15 minutos a 20 a 26 °C, lo que causa el revelado de un color azul. El revelado del color se detiene con la adición de la solución de parada, que cambia el color a amarillo.

El recambio enzimático del sustrato se determina mediante espectrofotometría a 450 nm, preferiblemente con corrección a 630 nm, y es directamente proporcional a la concentración de MPO. Las absorbancias de los calibradores se emplean para trazar una curva de calibración de absorbancia frente a concentración de MPO, desde la cual se puede determinar la concentración de MPO en los controles o en las muestras.

REACTIVOS Y MATERIALES

Materiales suministrados con el equipo:

Microplaca de titulación, recubierta con anticuerpo anti-MPO, placa de 96 pocillos

Microplaca de titulación recubierta con anticuerpo monoclonal específico de la MPO, 12 tiras de 8 pocillos cada una.

Solución amortiguadora de análisis, 100 ml

Solución salina amortiguada con citrato, que contiene detergentes y aditivos.

Conjugado de anticuerpo anti-MPO, 13 ml, amarillo

Solución amarilla de un anticuerpo monoclonal específico de la MPO, conjugado con HRP.

Reactivo de sustrato TMB, 13 ml

Solución de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. PROTÉJASE DE LA EXPOSICIÓN PROLONGADA A LA LUZ

20

Solución de parada, 13 ml

Solución de ácido sulfúrico (0,4 N) en agua. Manténgase herméticamente cerrado. PRECAUCIÓN: IRRITANTE.

Concentrado de solución amortiguadora de lavado 25X, 40 ml

Solución salina amortiguada con Tris, que contiene detergentes.

Sellador de placas, 2

Sellador de bolsas, 1

Materiales necesarios pero no suministrados:

Equipo de calibradores CardioMPO™, 5 concentraciones de MPO (A-E); 1,1 ml cada uno Número de catálogo 9601

MPO en plasma humano con heparina litio, diluido en solución amortiguadora de análisis. Compruebe las concentraciones reales en cada etiqueta del calibrador. PRECAUCIÓN: CONTIENE MATERIAL DE ORIGEN HUMANO. TRATAR COMO POTENCIALMENTE INFECCIOSO.

Equipo de controles CardioMPO™, 3 concentraciones de MPO (1 a 3); 0,5 ml cada uno Número de catálogo 8601

MPO en plasma humano con heparina litio. Compruebe los intervalos de concentración real en la etiqueta de cada control. PRECAUCIÓN: CONTIENE MATERIAL DE ORIGEN HUMANO. TRATAR COMO POTENCIALMENTE INFECCIOSO.

Pipetas de precisión, monocanal y multicanal, para volúmenes de 10 μl a 1000 μl, con puntas de polipropileno desechables.

Agua desionizada tipo I o destilada.

Probetas graduadas.

Mezclador de vórtice o equivalente.

Agitador orbital de microplacas capaz de funcionar a 500 r.p.m.

Toallas de papel absorbente.

Lavadora de microplacas.

Lector de microplacas capaz de leer a 450 nm, preferiblemente con corrección a 630 nm.

Programa informático capaz de ajustar correctamente la curva, para calcular la concentración de MPO a partir de la densidad óptica de los calibradores (opcional).

Papel de gráficos para la reducción manual de datos (opcional).

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

Para diagnóstico in vitro.

Sólo para uso por profesionales.

Todas las muestras de plasma se deberán tratar como si fueran material potencialmente biopeligroso.

Deberán seguirse los métodos adecuados de manipulación y eliminación, con arreglo a las normativas locales, regionales y estatales.

21

El reactivo de sustrato TMB contiene 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB). Si la piel se expone a este compuesto, lavar inmediatamente la zona con agua y jabón. Si los ojos se exponen a este compuesto, lavar con abundante agua y buscar atención médica inmediata.

La solución de parada contiene ácido sulfúrico 0,4 N. Si la piel se expone a este compuesto, lavar inmediatamente la zona con agua y jabón. Si los ojos se exponen a este compuesto, lavar con abundante agua y solicitar atención médica inmediata.

No usar reactivos caducados.

No volver a utilizar los pocillos de las microplacas.

No mezclar los componentes de otros lotes de los equipos de reactivos CardioMPO™.

Los controles no se suministran con el equipo, pero pueden adquirirse por separado (número de catálogo 8601). Incluir los controles CardioMPO™ en cada análisis de paciente. Si los valores de los controles no están dentro de los límites aceptables, será necesario repetir el análisis.

CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS

Los equipos de prueba sin abrir deberán mantenerse refrigerados (2 a 8 ºC) a su llegada y hasta la fecha de caducidad. Las tiras de pocillos de las microplacas sin usar deberán guardarse selladas en la bolsa de aluminio, con desecante, a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si los equipos de análisis sin abrir se almacenan según las instrucciones, permanecerán estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. No usar ningún reactivo que muestre signos de decoloración, turbidez, precipitación o derrame.

RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS

Las muestras de sangre deberán recogerse en tubos de recogida con heparina litio, mediante una técnica aséptica de venopunción. Las muestras deberán mezclarse bien mediante inversión para asegurar resultados exactos. Las muestras de heparina litio deberán colocarse inmediatamente en hielo o a 2 a 8 ºC, y guardarse a 2 a 8 ºC hasta su separación. El plasma deberá separarse de las células por medio de un procedimiento habitual de separación, preferiblemente en una centrífuga refrigerada. Las directivas del CLSI (antiguamente NCCLS) recomiendan un máximo de dos horas a partir de la hora de recogida.5 El plasma separado deberá permanecer a una temperatura de 20 a 26 °C durante durante no más de 8 horas. Si los análisis no se van a terminar en ocho horas, el plasma deberá refrigerarse (2 a 8 ºC). Se ha comprobado que las concentraciones de CardioMPO™ en plasma permanecen estables durante ocho días, a una temperatura de 2 a 8 °C. Si los análisis no se finalizan en ocho días o el plasma separado se va a almacenar más de ocho días, deberá conservarse congelado, a una temperatura igual o inferior a -15 ºC. Las muestras de los pacientes no deben congelarse y descongelarse repetidamente, dado que ello puede causar el deterioro del analito. Se ha comprobado que las concentraciones de CardioMPO™ en plasma permanecen estables durante dos ciclos de congelación y descongelación. 22

PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS

Notas sobre el procedimiento

1. Dejar que los reactivos, las muestras, los calibradores y los controles se calienten a temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC) durante 30 minutos por lo menos, antes de su uso.

2. Agitar las muestras, los calibradores y los controles en vórtice, para que se mezclen bien. Evítese la formación de espuma.

3. Retirar de la bolsa de aluminio el marco de las tiras de pocillos y el número necesario de tiras de microtitulación recubiertas, después de llevar la placa a temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC). Colocar las tiras de pocillos sin usar en la bolsa de aluminio, con el desecante; volver a cerrar herméticamente conservar a una temperatura de 2 a 8 °C.

4. Usar una punta de polipropileno nueva para cada reactivo, calibrador, control o muestra, para evitar la contaminación.

5. Todos los calibradores, controles y muestras deberán analizarse por duplicado.

6. Antes de añadir el conjugado de anticuerpo anti-MPO y el reactivo de sustrato de TMB, asegurarse de que no queden restos de solución amortiguadora de lavado en los pocillos. Los restos de solución amortiguadora de lavado pueden producir una variación de los resultados de la prueba.

7. Para una determinación exacta, la adición de muestras, calibradores y controles debe ser precisa. Pipetear con cuidado, usando exclusivamente un equipo calibrado.

8. Todos los componentes del equipo, salvo el concentrado de solución amortiguadora de lavado, se entregan listos para usar. Consultar el siguiente procedimiento para la preparación de la solución amortiguadora de lavado.

Preparación de la solución amortiguadora de lavado de trabajo 1X

Antes de usar, dejar que el concentrado de solución amortiguadora de lavado alcance la temperatura ambiente (de 20 a 26 °C). Preparar solución amortiguadora de lavado de trabajo 1X vertiendo un frasco del concentrado de solución amortiguadora de lavado 25X en un recipiente limpio de un litro. Aclarar el frasco con agua desionizada tipo I para eliminar los restos de solución amortiguadora y disolver los cristales. Añadir el aclarado, diluir con agua desionizada tipo I hasta un volumen total de 1,0 litros y mezclar bien. Si se conserva a una temperatura de 2 a 8 ºC, la solución amortiguadora de lavado de trabajo 1X permanece estable hasta dos meses.

23

Preparación de las placas

1. Pipetear 100 μl de cada calibrador CardioMPO™ en los pocillos correspondientes de la microplaca de titulación recubierta.

2. Pipetear 90 μl de solución amortiguadora de análisis en los pocillos correspondientes de la microplaca de titulación destinada a las muestras y los controles.

3. Pipetear 10 μl de muestras y controles bien mezclados en los pocillos correspondientes.

Incubación de la muestra

1. Sellar la placa con el sellador de placas proporcionado e incubar en un agitador de placas ajustado a 500 r.p.m. durante 45 minutos a temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC).

2. Al final del período de incubación, lavar cuatro veces las microplacas de titulación con 400 μl de solución amortiguadora de lavado de trabajo. Después del lavado final, aspirar los pocillos.

3. Secar la placa en toallas de papel absorbente después del lavado final para eliminar los restos de solución amortiguadora de lavado. No dejar que los pocillos se sequen. Pasar inmediatamente al siguiente paso.

Incubación con el conjungado de anticuerpo:

1. Pipetear en cada pocillo 100 μl de conjugado de anticuerpo anti-MPO.

2. Sellar la placa con el sellador de placas proporcionado e incubar en un agitador de placas ajustado a 500 r.p.m. durante 45 minutos a temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC).

3. Al final del período de incubación, lavar cuatro veces las microplacas de titulación con 400 μl de solución amortiguadora de lavado de trabajo. Después del lavado final, aspirar los pocillos.

4. Secar la placa en toallas de papel absorbente después del lavado final para eliminar la solución amortiguadora de lavado restante. No dejar que los pocillos se sequen. Pasar inmediatamente al siguiente paso.

Incubación del sustrato y revelado del color

1. Pipetear en cada pocillo 100 μl de reactivo de sustrato TMB.

2. Incubar la placa en un agitador de placas ajustado a 500 r.p.m. durante 15 minutos a temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC).

Parada y lectura

1. Detener la reacción, añadiendo a cada pocillo 100 μl de solución de parada.

2. Girar la placa con cuidado sobre una superficie plana para mezclar. Asegurarse de que el color azul haya cambiado completamente a amarillo.

3. Leer la densidad óptica a 450 nm con un lector de microplacas de titulación. Se recomienda una corrección de fondo a 630 nm.

24

CÁLCULO DE LOS RESULTADOS

1. Trazar una curva de calibración usando el programa informático adecuado. Se recomienda un ajuste de la curva de cuatro parámetros. Pueden hacerse cálculos manuales mediante el trazado de la absorbancia media obtenida con cada calibrador en el eje Y, frente a la concentración de MPO (pmol/l) en el eje X.

2. Con el valor de absorbancia media de cada muestra y control, determinar la concentración correspondiente de MPO en pmol/l, a partir de la curva de calibración. La concentración de MPO asignada a cada calibrador refleja el empleo de 10 μl de muestra (una dilución a 1:10 en la placa), de modo que no se requieren más cálculos.

3. Las muestras con concentraciones de MPO superiores al valor del calibrador más alto pueden notificarse como superiores a dicha concentración, por ejemplo, >8000 pmol/l. No se recomienda diluir más las muestras.

25

EJEMPLO DE CURVA DE CALIBRACIÓN

Resultados de una curva de calibración típica con las lecturas de D.O. a 450 nm, corrección a 630 nm, en el eje Y, frente a las concentraciones de MPO (pmol/l) en el eje X. El usuario deberá generar una nueva curva de calibración con cada prueba realizada. La siguiente curva de calibración se presenta sólo con fines ilustrativos.

Calibrador

Concentración de MPO (pmol/l)

Absorbancia media

(D.O. a 450 nm,

corrección a 630 nm)

A

8020

2,630

B

3650

2,000

C

1580

1,108

D

490

0,346

E

0

0,031 Curva de calibración00.511.522.530100020003000400050006000700080009000Concentración (pmol/L)OD

26

LIMITACIONES

Procedimiento

Se obtendrán resultados fiables y reproducibles si el procedimiento del análisis se lleva conociendo completamente las instrucciones del prospecto del envase y cumpliendo las buenas prácticas de laboratorio.

Los procedimientos de lavado son fundamentales. Un lavado insuficiente tendrá como resultado unas lecturas de absorbancia falsamente altas o bajas.

Como con cualquier sistema de análisis que emplea anticuerpos animales, existe la posibilidad de interferencia por los anticuerpos heterófilos, por ejemplo los anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA), presentes en la muestra, que podrían ser causa de valores falsamente altos o bajos.

Otros factores, como los errores técnicos o de procedimiento, pueden interferir con el análisis CardioMPOy pueden dar unos resultados erróneos.

Interpretación clínica

Las concentraciones de MPO deberán interpretarse junto a los resultados clínicos y a otras pruebas de diagnóstico.

Esta prueba no está diseñada para sustituir otros factores de riesgo tradicionales identificados para la cardiopatía coronaria, como el electrocardiograma, el historial clínico, los marcadores de necrosis miocárdica, etc.

VALORES ESPERADOS

Se evaluaron las muestras de plasma de hombres (n = 150) y mujeres (n = 150), de una población de donantes de sangre aparentemente sanos, con el análisis CardioMPO™. Para eliminar siete valores aberrantes se empleó un esquema de detección de valores aberrantes en dos fases, una transformación de Box-Cox seguida de un método potente de detección de valores aberrantes.6 Dado que no hubo ninguna diferencia significativa entre las concentraciones de MPO por sexo, se calculó el intervalo de referencia a partir de toda la población, después de ajustar los valores aberrantes.

La mediana de la concentración de MPO en los pacientes del banco de datos ajustado fue de 340 pmol/l y los límites de los resultados fueron 137 y 984 pmol/l. La distribución no paramétrica de las concentraciones de mieloperoxidasa en esta población normal da un intervalo de referencia del 95%, central y bilateral, con corrección del efecto del rechazo de los valores aberrantes, de 156 a 734 pmol/l. Sin embargo, en esta aplicación, el intervalo inferior de referencia del 95%, unilateral y más adecuado, también con corrección del método de rechazo de valores aberrantes, es < 640 pmol/l.

27

CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO

Sensibilidad

El límite mínimo de detección, calculado mediante la interpolación de la media más dos desviaciones típicas de 26 duplicados del calibrador de MPO a 0 pmol/l (E), es de 14 pmol/l de MPO.

Precisión del análisis

Se determinó la precisión total e intra-análisis mediante el examen de seis muestras de prueba de plasma con heparina litio con concentraciones de MPO distribuidas en todo el intervalo de calibración del análisis, según la directiva EP5-A del CLSI (antiguamente NCCLS). Estas muestras se analizaron por duplicado, con un solo lote de reactivos y calibradores, en dos placas separadas al día, durante 20 días. Se analizó una nueva curva de calibración por duplicado en cada placa. Los resultados del estudio de precisión se resumen en el siguiente cuadro.

Cuadro 4. Resumen de los resultados del estudio de precisión.

Nombre de la muestra

Concentración de MPO de prueba (pmol/l)

Número de repeticiones

% CV total

% CV intra-análisis

Muestra 1 de plasma con heparina litio

307

80

10,2%

5,8%

Muestra 2 de plasma con heparina litio

610

80

5,8%

5,0%

Muestra 3 de plasma con heparina litio

1285

76*

7,4%

5,7%

Muestra 4 de plasma con heparina litio

1459

80

8,9%

8,6%

Muestra 5 de plasma con heparina litio

2745

80

9,0%

9,0%

Muestra 6 de plasma con heparina litio

4758

80

8,7%

6,4%

Promedio

8,3%

6,7%

* Se excluyó del análisis 1 día de datos debido a valores aberrantes grandes.

Linealidad

Las muestras de plasma con heparina litio a las que se les habían añadido cantidades conocidas a concentraciones altas de MPO se entremezclaron con muestras de plasma limpio con concentraciones bajas de MPO para crear nueve concentraciones de MPO a través del intervalo lineal previsto y superior al mismo. Se evaluó la linealidad de las concentraciones de MPO determinadas en las mezclas mediante la evaluación polinómica de linealidad, recomendada en la directiva EP6-A del CLSI (antiguamente NCCLS). En el plasma con heparina litio, el análisis CardioMPO™ ha demostrado ser lineal en el intervalo de 14 pmol/l a 9410 pmol/l de MPO, dentro de 60 pmol/l o el 6% en este intervalo.

28

Recuperación de las cantidades conocidas añadidas

A 9 muestras de plasma con heparina litio se les añadieron 497, 1456 y 2851 pmol/l de MPO, y se analizó la recuperación. Se calculó el porcentaje de recuperación dividiendo la concentración media determinada de MPO de la muestra a la que se añadieron cantidades conocidas por la concentración esperada de MPO, donde esta concentración esperada de MPO fue la suma de la concentración determinada de MPO en la muestra de plasma limpio y la concentración de la MPO con cantidades añadidas. La recuperación promedio de la MPO con cantidades añadidas en el plasma con heparina litio varió entre el 87% y el 117%, con una media del 100,7%.

Recuperación de la dilución

A 9 muestras de plasma con heparina litio se les añadió 2851 pmol/l de MPO, y se diluyeron a 1:2, 1:4 y 1:8 con solución amortiguadora de análisis. Se calculó el porcentaje de recuperación dividiendo la concentración media de MPO de la muestra prediluida, multiplicada por el factor de dilución, por la concentración media de MPO de la muestra sin predilución. La recuperación media de una dilución 1:2 fue del 113% en el caso del plasma con heparina litio;las recuperaciones variaron entre el 107% y el 117%.

La prueba CardioMPO™ de PrognostiX se formula para explicar los efectos de matriz asociados a una muestra de 10 μl de plasma humano. PrognostiX no recomienda diluir más las muestras. Las muestras con concentraciones de MPO superiores al valor del calibrador más alto deberán notificarse como superiores a dicha concentración, por ejemplo, >8000 pmol/l. Sin embargo, puede procesarse una dilución 1:2, con material de laboratorio de polipropileno, con el conocimiento de que la concentración de MPO obtenida a partir de dicha medición será ~13% superior a su valor real.

29

Reactividad cruzada

Los posibles componentes con reacción cruzada que se muestran en el siguiente cuadro fueron examinados con plasma con heparina litio,según la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS). Todas las proteínas investigadas presentaron una reactividad cruzada inferior al 0,007% a la concentración de análisis más alta, y una reactividad cruzada inferior al 1,7% a la concentración de análisis más baja, cuando se añadió a un grupo de plasmas con heparina litio.

Sustancia examinada

Concentraciones examinadas (nmol/l)

antitripsina α-1, humana

1250, 125, 12,5

Proteína C reactiva, humana

543, 54,3, 5,43

Lisozima, humana

4464, 446,4, 44,64

IgA, humana

417, 41,7, 4,17

Elastasa, humana

2500, 250, 25

Peroxidasa de eosinófilos, humana

887, 88,7, 8,87

Lactoperoxidasa, bovina

801, 80,1, 8,01

Lactoferrina, humana

781, 78,1, 7,81

COX1, ovina

893, 89,3, 8,93

COX2, humana

868, 86,8, 8,68

Peroxidasa tiroidea, humana

595, 59,5, 5,95

Troponina I, humana

2155, 215,5, 21,55

30

Sustancias interferentes

Se observó que las sustancias presentadas en el siguiente cuadro, al ser examinadas en plasma que contiene 3000 pmol/l y 1000 pmol/l de MPO según la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS), no interfieren hasta las concentraciones indicadas. Una desviación del 10% o menos no se consideró interferencia.

Sustancia examinada

Concentración de prueba (mg/l)

Comentarios

Ácido acetilsalicílico

600

Dosis tóxica

Albúmina

50000

Alta*

Amoxicilina

75

3x dosis terapéutica

Bilirrubina conjugada

50

Alta*

Bilirrubina no conjugada

150

Alta*

Captoprilo

5

Dosis tóxica

Ceruloplasmina

600

Alta

Colesterol

1000

Alta*

ADN

16,7

Alta

Fenofibrato

45

3x dosis terapéutica

Hemoglobina

5000

Hemólisis*

Heparina litio

3000 U/l

3x dosis terapéutica

Hidroclorotiazida

6

3x dosis terapéutica

Hidrocortisona

0,69

Dosis tóxica

Ibuprofeno

500

Dosis tóxica

Indometacina

36

2x dosis terapéutica

Dinitrato de isosorbida

0,15

3x dosis terapéutica

Lovastatina

53

2x dosis terapéutica

Metotrexato

160

Dosis terapéutica

Metoprolol

5

Dosis tóxica

Naproxeno

500

4x dosis terapéutica

Niacina

0,5

5x dosis terapéutica

Nifedipina

0,4

2x dosis terapéutica

Ácido salicílico

600

Dosis tóxica

Azida sódica

0,50%

5x dosis conservante

Triglicéridos

5000

Lipemia

* Concentración alta de sustancia interferente según la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS).

Gancho (Hook)

En el análisis CardioMPO™ no hay indicios del efecto de gancho hasta 1 μmol/l de MPO, aproximadamente 100 veces superior al límite superior del intervalo notificable, y 600 veces superior a la mediana de la concentración de los pacientes del estudio clínico.

31

Anticuerpos interferentes

Se analizó la interferencia de veinte muestras conocidas por tener niveles elevados de HAMA (anticuerpo humano anti-ratón) o RF en la prueba CardioMPO. La recuperación media de mieloperoxidasa (MPO) en estas muestras fue del 100% con recuperaciones individuales que variaban desde el 96% al 109%. Diez muestras conocidas por tener anticuerpos anti-MPO p-ANCA mostraron una recuperación media del 40% con recuperaciones individuales que variaron del 37% al 43%. Por lo tanto, no hubo evidencia de interferencia significativa debida a HAMA o RF; sin embargo, los niveles aparentes de mieloperoxidasa pueden disminuir en presencia de anticuerpos anti-MPO p-ANCA.

ESTUDIO CLÍNICO

Para determinar la eficacia del análisis CardioMPO™ de PrognostiX como factor predisponente de riesgo de episodios cardíacos adversos mayores, se determinaron las concentraciones de mieloperoxidasa en un banco de 560 muestras de plasma de un estudio de pacientes que acudieron al servicio de urgencias en las 24 horas siguientes a la aparición de dolor precordial.2 Se hizo un seguimiento de los participantes para determinar la aparición de un infarto de miocardio, la necesidad de revascularización (cirugía de derivación coronaria, intervención coronaria percutánea o cateterismo con estenosis al menos en dos vasos coronarios mayores de más del 70%), o muerte en los seis meses posteriores. Las muestras analizadas con la prueba CardioMPO™ procedían de pacientes de 23 a 96 años, con una mediana de edad de 64. El diagnóstico clínico se estableció tal como se ha explicado anteriormente.7 La incidencia de episodios cardíacos adversos mayores se evaluó mediante llamadas telefónicas en los 30 días y seis meses posteriores.

Se elaboraron modelos de regresión logística multivariante (SAS, versión 8.0, SAS Institute, EE.UU.) para calcular la relación de posibilidades y los intervalos de confianza del 95%. Las covariantes ajustadas fueron la edad, el sexo, la raza, la troponina T (≤0,03 ng/ml frente a >0,03 ng/ml)7, proteína C reactiva(<1 mg/l, de 1 a 3 mg/l, >3 mg/l)2, CK-MB (≤8,8 ng/ml en comparación con >8,8 ng/ml)7, los antecedentes de tabaquismo, los antecedentes de diabetes, los antecedentes de hipertensión y los antecedentes de colesterol elevado. La información ausente sobre covariantes en algunos pacientes redujo la población del estudio.

El riesgo de episodios cardíacos adversos mayores en todos los pacientes en los 30 días posteriores aumentó al aumentar los cuartiles de las concentraciones de mieloperoxidasa.

Un análisis similar de pacientes que fueron continuamente negativos a la troponina T (≤0,03 ng/ml) también reveló un riesgo significativamente más alto de episodios cardíacos adversos mayores en los pacientes con concentraciones de MPO en plasma en los cuartiles superiores. La razón de posibilidades ajustada y el porcentaje de pacientes con un cuartil de MPO con y sin episodios cardíacos adversos mayores a los 30 días se muestran en los siguientes gráficos y cuadros.

32

Riesgo de ECAM en todos los pacientes

ECAM a los 30 días, todos los pacientes (n = 523)

100

Pacientes dentro del cuartil (%)

90

80

70

60

ECAM

50

Sin ECAM

40

30

20

0

10

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

MPO por cuartil (pmol/l)

MPO (pmol/l)

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

Razón de posibilidades

1,0

2,5

2,8

3,3

I.C. 95%

n.d.

de 1,3 a 4,8

de 1,5 a 5,6

de 1,7 a 6,4

Valor de p

p = 0,007

p = 0,0021

p < 0,001

*En cada análisis, el primer cuartil sirvió como grupo de referencia.

Riesgo de ECAM en pacientes con troponina T continuamente negativa

100

Pacientes dentro del cuartil (%)

90

80

70

60

ECAM

50

Sin ECAM

40

30

20

0

10

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

MPO por cuartil (pmol/l)

ECAM a los 30 días, pacientes con TnT negativa (n = 304)

MPO (pmol/l)

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

Razón de posibilidades

1,0

3,4

4,1

6,9

I.C. 95%

n.d.

1,2-9,4

1,5-11,4

2,5-19,2

Valor de p

p = 0,0194

p =0,007

p < 0,001

*En cada análisis, el primer cuartil sirvió como grupo de referencia.

Debe señalarse que los distintos valores discriminatorios pueden ser adecuados para poblaciones clínicas diferentes.

33

BIBLIOGRAFÍA

1. Klebanoff SJ, y cols. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brennan ML, y cols. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

3. Hazen, SL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004: 24(7): 1143-1146.

4. Engvall E, Perlman P. Immunochemistry, 1971 8(9): 871-874.

5. CLSI (antiguamente NCCLS). Document H18-A2 1999 NCCLS Wayne, PA.

6. Horn, y cols. Clinical Chemistry 2001; 47/12: 2137-2145.

7. McErlean, ES, y cols. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

GARANTÍA

Este producto está garantizado para funcionar de la manera que se describe en el etiquetado y en la bibliografía de Prognostix, Inc., si se utiliza cumpliendo estrictamente las instrucciones publicadas en relación con el uso de este producto. Prognostix, Inc. no ofrece ninguna otra garantía, explícita o implícita, y SE EXIME DE RESPONSABILIDAD DE CUALQUIER GARQANTÍA IMPLÍCITA DE COMERCIABILIDAD O IDONEIDAD PARA UN FIN EN CONCRETO. EN NINGÚN CASO, PROGNOSTIX, INC. SERÁ RESPONSABLE DE NINGÚN DAÑO INDIRECTO, ESPECIAL O CONSECUENCIAL.

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Fax: +31 (0)70 346 7299

Este producto está cubierto por la solicitud de patente EE.UU. 20020164662.

CardioMPO™ es una marca comercial pendiente de PrognostiX, Inc. 34

Equipo de reactivos para inmunoanálisis enzimático CardioMPO

Número de catálogo: 7501

Guía de referencia rápida de CardioMPOde PROGNOSTIX

1. Esperar que todos los reactivos, calibradores, controles y muestras de pacientes se calienten a la temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC) durante 30 minutos como mínimo, antes de su uso.

2. Agitar en vórtice los calibradores, controles y muestras, para que se mezclen bien.

3. Pipetear 100 μl de cada uno de los calibradores CardioMPO™ en las microplacas de titulación adecuadas.

4. Pipetear 90 μl de solución amortiguadora de análisis y todas las microplacas de titulación de las muestras y controles.

5. Pipetear 10 μl de muestra del paciente o los controles CardioMPO™ en microplacas de titulación adecuadas.

6. Sellar e incubar durante 45 minutos, rotando a 500 r.p.m.

7. Lavar cuatro veces con 400 μl de solución amortiguadora de lavado de trabajo y secar para eliminar el exceso de solución amortiguadora.

8. Añadir a cada pocillo 100 μl de conjugado de anticuerpo anti-MPO (amarillo).

9. Sellar e incubar durante 45 minutos, rotando a 500 r.p.m.

10. Lavar cuatro veces con 400 μl de solución amortiguadora de lavado de trabajo y secar para eliminar el exceso de solución amortiguadora.

11. Añadir a cada pocillo 100 μl de reactivo de sustrato TMB.

12. Incubar durante 15 minutos, rotando a 500 r.p.m.

13. Añadir 100 μl de solución de parada a cada pocillo y girar para que se mezcle.

14. Leer la absorbancia a 450 nm, preferiblemente con corrección a 630 nm.

Mapa de microplacas de titulación CardioMPO™ de PROGNOSTIX recomendadas

Puede ser necesario colocar los calibradores y los controles en posiciones diferentes, según el número de muestras analizadas.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

CAL A

2

6

9

13

17

20

24

28

CTL3

35

39

B

CAL B

3

7

10

14

18

21

25

29

CTL3

36

40

C

CAL C

3

CTL1

10

14

18

21

25

29

32

36

40

D

CAL D

4

CTL1

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL A

E

CAL E

4

7

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL B

F

1

5

8

12

16

20

23

27

31

34

38

CAL C

G

1

5

8

12

16

CTL2

23

27

31

34

38

CAL D

H

2

6

9

13

17

CTL2

24

28

32

35

39

CAL E

35

Cardio MPOMC

Kit de réactifs pour dosage immunoenzymatique

UTILISATION PRÉVUE

Le kit de réactifs CardioMPOMC permet de réaliser un dosage immunoenzymatique destiné à la détermination quantitative de la myéloperoxydase dans le plasma humain et doit être utilisé conjointement avec les antécédents cliniques, l’ECG et les biomarqueurs cardiaques pour évaluer l’état des patients souffrant de douleurs thoraciques et présentant un risque d’événements cardiaques indésirables majeurs, dont l’infarctus du myocarde, le besoin de revascularisation ou le décès.

SOMMAIRE ET EXPLICATION

L’activation des leucocytes stimule la sécrétion de MPO et la production d’oxydants1. Plusieurs sources de données indiquent que l’enzyme myéloperoxydase (MPO), sécrétée par les leucocytes, participe à l’évolution de l’athérosclérose et favorise la fragilité de la plaque2,3. La MPO a été liée au ramollissement de la plaque lipidique, à l’activation des cascades de protéases affectant la stabilité et la thrombogénécité de la plaque, à la production de lipides oxydés cytotoxiques et prothrombogéniques, et à la consommation de monoxyde d’azote, ce qui entraîne une vasoconstriction.3

La concentration plasmatique de MPO dans les échantillons de patients prélevés au cours de la période d’évaluation dans le contexte d’un syndrome coronaire aigu à l’urgence est un facteur prédictif du risque d’événements cardiaques indésirables majeurs (ÉCIM) — dont l’infarctus du myocarde, le besoin de revascularisation ou le décès — au cours des 30 jours suivants et des 6 mois suivants2. Le risque relatif approché d’ÉCIM augmente proportionnellement aux taux plasmatiques de MPO dans tous les quartiles de la population. La valeur prédictive de la concentration de MPO est indépendante de l’âge, du sexe, de l’appartenance ethnique, du taux de CRP, du taux de troponine T, du taux de CK-MB et des antécédents de diabète, de tabagisme, d’hyperlipidémie et d’hypertension.

PRINCIPE DU TEST

Le kit de réactifs CardioMPOMC permet de réaliser un dosage immunoenzymatique dit en « sandwich »4 pour mesurer la concentration de MPO dans le plasma humain. Le kit de contrôles CardioMPOMC et le kit de calibrateurs CardioMPOMC doivent être utilisés conjointement avec le kit de réactifs CardioMPOMC, mais sont fournis séparément pour des raisons pratiques de facilité d’emballage et de manipulation.

36

Le kit de calibrateurs CardioMPOMC contient 5 calibrateurs (A-E) à utiliser avec le kit de réactifs CardioMPOMC. Les valeurs des calibrateurs sont fournies sur les étiquettes de chaque calibrateur. Les calibrateurs sont fournis prêts à l’emploi.

Le kit de contrôles CardioMPOMC contient 3 contrôles (1-3) à utiliser également avec le kit de réactifs CardioMPOMC. Les plages de concentrations réelles des contrôles sont indiquées sur les étiquettes de chaque contrôle. Les contrôles sont traités de la même manière que les échantillons des patients.

Les calibrateurs sont ajoutés directement aux puits appropriés de la microplaque. Le tampon de dosage est ajouté à tous les puits destinés à l’analyse du contrôle ou de l’échantillon. Des parties aliquotes de contrôles ou d’échantillons sont ajoutées aux puits appropriés et la plaque est incubée pendant 45 minutes entre 20 et 26 °C. Les puits sont ensuite lavés avec un tampon de lavage pour éliminer les antigènes qui ne sont pas liés spécifiquement à l’anticorps immobilisé.

Un anticorps monoclonal anti-MPO marqué à la peroxydase de raifort (HRP) est alors ajouté à chaque puits et incubé pendant 45 minutes entre 20 et 26°C. L’anticorps conjugué se lie à la MPO adsorbée sur la plaque, puis la MPO de l’échantillon est « mise en sandwich » entre l’anticorps de la phase solide et l’anticorps conjugué. La plaque est lavée de nouveau avec le tampon de lavage pour éliminer les anticorps marqués à la HRP non liés.

Le substrat, la tétraméthylbenzidine (TMB), est alors ajouté à chaque puits et, pendant l’incubation de 15 minutes entre 20 et 26°C, la solution se colore en bleu. La coloration est arrêtée par l’ajout de la solution d’arrêt, ce qui colore le tout en jaune.

La quantité d’enzyme utilisée par le substrat, qui est mesurée spectrophotométriquement à 450 nm, préférablement avec une correction de 630 nm, est directement proportionnelle à la concentration de MPO. Les absorbances des calibrateurs sont utilisées pour tracer une courbe d’étalonnage de l’absorbance par rapport à la concentration de MPO, laquelle permet de déterminer la concentration de MPO dans les contrôles ou les échantillons.

RÉACTIFS ET MATÉRIEL

Matériel fourni avec le kit:

Microplaque enduite d’anticorps anti-MPO, de 96 puits

Microplaque enduite d’anticorps monoclonaux murins anti-MPO, 12 rangées de 8 puits

Tampon, 100 ml

Solution saline tamponnée au citrate contenant des détergents et des additifs.

Conjugué d’anticorps anti-MPO, 13 ml, couleur jaune

Solution jaune d’anticorps monoclonaux murins anti-MPO conjugués à l’HRP.

Réactif du substrat TMB, 13 ml

Solution de 3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine (TMB) et de peroxyde d’hydrogène. TENIR À L’ABRI DES EXPOSITIONS PROLONGÉES À LA LUMIÈRE. 37

Solution d’arrêt, 13 ml

Solution aqueuse d’acide sulfurique (0,4 N) Tenir bien fermée.

MISE EN GARDE : IRRITANT.

Tampon de lavage concentré (25X), 40 ml

Solution saline tamponnée au Tris contenant des détergents.

Feuille scellante pour microplaque, 2

Dispositif de scellement pour pochette, 1

Matériel requis mais non fourni :

Kit de calibrateurs CardioMPOMC, 5 concentrations de MPO (A-E), 1,1 ml chacune Numéro de cat. 9601

MPO en tampon de phosphate avec protéines, détergents et stabilisateurs. Pour connaître les concentrations réelles, voir les étiquettes de chaque calibrateur.

Kit de contrôles CardioMPOMC, 3 concentrations de MPO (1-3), 0,5 ml chacune

Numéro de cat. 8601

MPO dans du plasma humain avec de l’héparine de lithium. Pour connaître les plages de concentrations réelles, voir les étiquettes de chaque contrôle . MISE EN GARDE : CONTIENT DU MATÉRIEL D’ORIGINE HUMAINE TRAITER COMME UN PRODUIT POTENTIELLEMENT INFECTIEUX.

Pipettes de précision à simple canal et à multiples canaux pour des volumes compris entre 10 μl et 1 000 μl avec embouts de pipette en polypropylène jetables

Eau désionisée de type I ou distillée

Cylindres gradués

Vortex ou mélangeur équivalent

Agitateur rotateur pour microplaque pouvant tourner à 500 tr/min

Papier absorbant

Laveur de microplaque

Lecteur de microplaque pouvant lire à 450 nm, de préférence avec correction à 630 nm

Logiciel pouvant bien ajuster la courbe pour calculer la concentration de MPO à partir de la densité optique des calibrateurs (en option)

Papier graphique pour la réduction manuelle des données (en option).

AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS

Pour usage diagnostique in vitro.

À usage professionnel uniquement.

Tous les échantillons de plasma doivent être traités comme des produits biologiques potentiellement dangereux.

Les méthodes de manipulation et de mise au rebut doivent être conformes aux réglementations locales et nationales.

38

Le réactif de substrat TMB contient de la 3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine (TMB). En cas de contact cutané, rincer immédiatement avec de l’eau et du savon. En cas de contact oculaire, rincer avec beaucoup d’eau et s’adresser immédiatement à un médecin.

La solution d’arrêt contient de l’acide sulfurique à 0,4 N. En cas de contact cutané, rincer immédiatement avec de l’eau et du savon. En cas de contact oculaire, rincer avec beaucoup d’eau et s’adresser immédiatement à un médecin.

Ne pas utiliser les réactifs après leur date de péremption.

Ne pas réutiliser les puits de microtitrage.

Ne pas mélanger les composants avec ceux d’autres lots de kits de réactifs CardioMPOMC.

Les contrôles ne sont pas fournis avec le kit, mais ils peuvent être achetés séparément (n° de cat. 8601). Inclure les contrôles CardioMPOMC dans chaque dosage de patient. Si les valeurs des contrôles ne sont pas dans des limites acceptables, le dosage doit être répété.

STOCKAGE DES RÉACTIFS

Les kits de tests non ouverts doivent être réfrigérés (entre 2 et 8 °C) dès leur réception et jusqu’à leur date de péremption. Les bandes de puits de microtitrage non utilisées doivent être conservées scellées dans un sachet en pellicule d’aluminium, avec un produit déshydratant, entre 2 et 8 °C. Les kits de tests non ouverts, stockés comme indiqué, restent stables jusqu’à la date de péremption figurant sur l’étiquette. Les réactifs présentant des signes de décoloration, de turbidité, de précipité ou de fuite ne doivent pas être utilisés.

PRÉLÈVEMENT ET STOCKAGE DES ÉCHANTILLONS

Les échantillons sanguins doivent être prélevés dans des tubes de prélèvement enduits d’héparine de lithium en utilisant une technique par ponction veineuse aseptique. Les échantillons doivent être parfaitement mélangés par inversion pour assurer l’exactitude des résultats. Les échantillons des tubes avec héparine de lithium doivent être placés immédiatement sur de la glace ou tenus à une température comprise entre 2 et 8 °C, et conservés entre 2 et 8 °C jusqu’à la séparation. Le plasma doit être séparé des cellules selon une procédure standard de séparation, préférablement dans une centrifugeuse réfrigérée. Un délai maximal de deux heures depuis le prélèvement est recommandé par les directives du CLSI (anciennement le NCCLS)5. Le plasma séparé ne doit pas rester entre 20 et 26 °C pendant plus de 8 heures. Si les dosages ne sont pas terminés en huit heures, le plasma doit être réfrigéré (2 à 8 °C). Il a été montré que les taux de CardioMPOMC dans le plasma étaient stables pendant 8 jours s’ils étaient conservés entre 2 et 8 °C. Si les dosages ne sont pas terminés dans les 8 jours ou si le plasma séparé doit être conservé au-delà de 8 jours, le plasma doit être congelé à une température inférieure ou égale à –15 °C. Les échantillons de plasma ne doivent pas être congelés et décongelés plusieurs fois pour ne pas détériorer les analytes. Il a été montré que les taux plasmatiques de CardioMPOMC étaient stables après deux cycles de gel/dégel.

39

PROTOCOLE

Remarques sur la procédure

1. Attendre au moins 30 minutes pour laisser les réactifs, les échantillons, les calibrateurs et les contrôles atteindre la température ambiante (20 à 26 °C) avant de les utiliser.

2. Passer les échantillons, les calibrateurs et les contrôles au vortex pour bien les mélanger. Éviter la formation de mousse.

3. Retirer le cadre des bandes de puits et le nombre voulu de bandes de microtitrage enduites du sachet en pellicule d’aluminium après avoir laissé la plaque atteindre la température ambiante (20 à 26 °C). Mettre les bandes de puits non utilisées dans le sachet en pellicule d’aluminium avec le produit déshydratant, resceller et conserver entre 2 et 8 °C.

4. Utiliser un nouvel embout de pipette en polypropylène pour chaque réactif, calibrateur, contrôle ou échantillon afin d’éviter la contamination.

5. Le dosage de tous les calibrateurs, les contrôles et les échantillons doit être répété deux fois.

6. Avant l’addition du conjugué d’anticorps anti-MPO et du réactif de substrat TMB, s’assurer qu’il n’y a pas de résidu de tampon de lavage dans les puits. Toute trace de tampon de lavage dans les puits peut causer des variations des résultats des tests.

7. Pour obtenir des mesures exactes, l’ajout d’échantillon, de calibrateurs et de contrôles doit se faire avec précision. Pipetter avec soin en utilisant uniquement des appareils calibrés.

8. Tous les composants des kits, à l’exception du concentré de tampon de lavage, sont fournis prêts à l’emploi. Se reporter au protocole ci-dessous pour préparer la solution de tampon de lavage.

Préparation du tampon de lavage à 1X

Laisser le concentré de tampon de lavage atteindre la température ambiante (20 à 26 °C) avant de l’utiliser. Préparer le tampon de lavage 1X en versant le flacon de concentré de tampon de lavage à 25X fourni dans un récipient propre de 1 litre. Rincer le flacon avec de l’eau désionisée de type 1 pour retirer le tampon résiduel et dissoudre les cristaux. Ajouter l’eau de rinçage, diluer avec de l’eau désionisée de type 1 pour obtenir un volume total de 1 litre et bien mélanger. Si le tampon de lavage à 1X est conservé entre 2 et 8 °C, il est stable pendant 2 mois.

40

Préparation de la plaque

1. Pipetter 100 μl de chaque calibrateur CardioMPOMC dans les puits appropriés de la microplaque enduite.

2. Pipetter 90 μl de tampon de dosage dans les puits appropriés de la microplaque destinée aux échantillons et aux contrôles.

3. Pipetter 10 μl d’échantillons et de contrôles bien mélangés dans les puits appropriés.

Incubation des échantillons

1. Sceller la plaque avec la feuille de scellement fournie et incuber sur un agitateur de plaque réglé à 500 tr/min pendant 45 minutes à la température ambiante (entre 20 et 26 °C).

2. À la fin de la période d’incubation, laver les puits de microtitrage 4 fois avec 400 μl de tampon de lavage. Après le dernier lavage, aspirer le contenu des puits.

3. Après le dernier lavage, tapoter la plaque contre du papier absorbant pour retirer le tampon de lavage qui pourrait rester. Ne pas laisser les puits sécher. Procéder immédiatement à l’étape suivante.

Incubation de l’anticorps conjugué

1. Pipetter 100 μl de conjugué d’anticorps anti-MPO dans chaque puits.

2. Sceller la plaque avec la feuille de scellement fournie et incuber sur un agitateur de plaque réglé à 500 tr/min pendant 45 minutes à la température ambiante (entre 20 et 26 °C).

3. À la fin de la période d’incubation, laver les puits de microtitrage 4 fois avec 400 μl de tampon de lavage. Après le dernier lavage, aspirer le contenu des puits.

4. Après le dernier lavage, tapoter la plaque contre du papier absorbant pour retirer le tampon de lavage qui pourrait rester. Ne pas laisser les puits sécher. Procéder immédiatement à l’étape suivante.

Incubation du substrat et développement de la couleur

1. Pipetter 100 μl de réactif de substrat TMB dans chaque puits.

2. Incuber sur un agitateur de plaque à 500 tr/min pendant 15 minutes à température ambiante (20 à 26 °C).

Arrêt et lecture

1. Arrêter la réaction en ajoutant 100 μl de solution d’arrêt dans chaque puits.

2. Faire tourner doucement la plaque sur une surface plane pour mélanger. S’assurer que toute la couleur bleue est devenue jaune.

3. Lire la densité optique à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque. Il est recommandé d’effectuer une correction d’arrière-plan à 630 nm.

41

CALCUL DES RÉSULTATS

1. Tracer une courbe d’étalonnage à l’aide d’un logiciel approprié. Une courbe à quatre paramètres est recommandée. Les calculs manuels peuvent être effectués en reportant l’absorbance moyenne obtenue pour chaque calibrateur sur l’axe des y pour chaque concentration de MPO (pmol/l) sur l’axe des x.

2. En utilisant la valeur d’absorbance moyenne pour chaque échantillon et contrôle, déterminer la concentration correspondante de MPO en pmol/l à l’aide de la courbe d’étalonnage. Le taux de MPO attribué à chaque calibrateur reflète l’utilisation du volume d’échantillon de 10 μl (une dilution de 1/10 dans la plaque), de sorte qu’il est inutile de faire d’autres calculs.

3. Les échantillons dont les taux de MPO dépassent la valeur maximale des calibrateurs peuvent être rapportés comme étant supérieurs à ce taux de calibrateur, par exemple > 8 000 pmol/l. Il n’est pas recommandé de diluer davantage les échantillons.

42

EXEMPLE DE COURBE D’ÉTALONNAGE

Les résultats d’une courbe d’étalonnage typique utilisant les relevés de densités optiques à 450 nm avec une correction à 630 nm sont indiqués sur l’axe des y par rapport à des concentrations de MPO (pmol/l) sur l’axe des x. L’utilisateur doit déterminer une nouvelle courbe d’étalonnage pour chaque test réalisé. La courbe d’étalonnage suivante est donnée uniquement à titre d’exemple.

Calibrateur

Taux de MPO (pmol/l)

Absorbance moyenne

(D.O. à 450 nm,

correction à 630 nm)

A

8 020

2,630

B

3 650

2,000

C

1 580

1,108

D

490

0,346

E

0

0,031 Courbe d’étalonnage00.511.522.530100020003000400050006000700080009000Concentration (pmol/l)OD

43

LIMITATIONS

Protocole

On obtient des résultats fiables et reproductibles lorsque le protocole de dosage est exécuté avec une compréhension parfaite des directives de la notice d’accompagnement du produit et l’adhésion aux bonnes pratiques de laboratoire.

Les procédures de lavage sont essentielles. Un lavage insuffisant nuit à la précision et provoque des lectures d’absorbance faussement élevées ou basses.

Comme avec tout dosage utilisant des anticorps d’origine animale, il peut exister une interférence provenant des anticorps hétérophiles tels que les anticorps humains anti-souris (HAMA) présents dans l’échantillon et pouvant faussement élever ou baisser les valeurs.

D’autres facteurs, dont des erreurs techniques ou procédurales, peuvent interférer avec le test CardioMPOMC et être à l’origine de résultats erronés.

Interprétation clinique

Les taux de MPO doivent être interprétés à la lumière d’autres examens cliniques et d’autres tests diagnostiques.

Ce test ne vise pas à remplacer les autres tests habituels des coronaropathies tels que l’ECG, les antécédents cliniques, les marqueurs de nécrose myocardique, etc.

VALEURS PRÉVUES

Des échantillons sanguins provenant de donneurs de sexe masculin (n = 150) et féminin (n = 150) apparemment en bonne santé ont été évalués avec le test CardioMPOMC. Un système de détection de points aberrants à deux stades, une transformation de Box-Cox suivie d’une méthode robuste de détection de points aberrants, a été utilisé pour éliminer sept points aberrants6. Puisqu’il n’y avait pas de différence significative entre les taux de MPO par sexe, la plage de référence a été estimée en utilisant la population entière après avoir tenu compte des points aberrants.

Le taux médian de MPO des sujets de la base de données ajustée était de 340 pmol/l et la plage des résultats était comprise entre 137 et 984 pmol/l. La distribution non paramétrique des taux de myéloperoxydase dans cette population normale donne un intervalle de référence de 95 % central bilatéral, corrigé pour tenir compte de l’influence du rejet des aberrations, compris entre 156 et 734 pmol/l. Cependant, dans cette application, l’intervalle de référence de 95 % inférieur bilatéral plus approprié, corrigé de nouveau pour tenir compte de l’influence du rejet des aberrations, est < 640 pmol/l.

44

CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE

Sensibilité

La limite de détection minimale, calculée par l’interpolation de la moyenne plus deux écarts-types de 26 réplicats du calibrateur (E) MPO à 0 pmol/l, est de 14 pmol/l MPO.

Précision du dosage

La précision totale et la précision entre chaque dosage ont été déterminées en testant 6 échantillons tests de plasma avec héparine de lithium contenant des concentrations de MPO couvrant toute la plage d’étalonnage du dosage, selon la directive EP5-A du CLSI (anciennement NCCLS). Ces échantillons ont été dosés en double, en utilisant un seul lot de réactifs et de calibrateurs, sur deux plaques séparées par jour, pendant 20 jours. Une nouvelle courbe d’étalonnage a été exécutée en double sur chaque plaque. Les résultats de l’étude de précision sont résumés au tableau suivant.

Tableau 4. Résumé des résultats de l’étude de précision

Nom de l’échantillon

Concentration de MPO du test (pmol/l)

Nombre de répétitions

% CV total

% CV par dosage

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 1

307

80

10,2%

5,8%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 2

610

80

5,8%

5,0%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 3

1 285

76*

7,4%

5,7%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 4

1 459

80

8,9%

8,6%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 5

2 745

80

9,0%

9,0%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 6

4 758

80

8,7%

6,4%

Moyenne

8,3%

6,7%

*Les données de 1 jour ont été exclues de l’analyse à cause de résultats très aberrants

45

Linéarité

Les échantillons de plasma avec de l’héparine de lithium ayant reçu des taux élevés de MPO ont été mélangés avec des échantillons de plasma ne contenant que de faibles taux de MPO, de manière à obtenir 9 concentrations de MPO qui couvrent toute la plage linéaire prévue et davantage. La linéarité des taux de MPO mesurés dans les mélanges a été évaluée en utilisant l’évaluation polynomiale de linéarité recommandée par la directive EP6-A du CLSI (anciennement NCCLS). Il a été démontré que le test CardioMPOMC était linéaire entre 14 pmol/l et 9 410 pmol/l de MPO, et dans 60 pmol/l ou 6 % dans cet intervalle, avec le plasma traité à l’héparine de lithium.

Récupération après ajout

Neuf échantillons de plasma traités à l’héparine de lithium ont été additionnés de 497, 1 456 et 2 851 pmol/l de MPO et analysés pour évaluer la récupération. Le pourcentage de récupération a été calculé en divisant la concentration moyenne de MPO mesurée dans l’échantillon additionné de MPO par la concentration prévue de MPO; la concentration prévue de MPO correspond à la somme de la concentration de MPO mesurée dans l’échantillon contenant seulement du plasma et de la concentration de MPO dans l’échantillon additionné de MPO. La récupération moyenne de MPO additionnée dans le plasma avec héparine de lithium était comprise entre 87 % et 117 %, la moyenne étant de 100,7 %.

Récupération par dilution

Neuf échantillons de plasma avec héparine de lithium ont été additionnés de 2 851 pmol/l de MPO et dilués à 1:2, 1:4 et 1:8 avec du tampon de dosage. Le pourcentage de récupération a été calculé en divisant la concentration moyenne de MPO dans l’échantillon prédilué, multiplié par le facteur de dilution, par la concentration moyenne de MPO dans l’échantillon non prédilué. La récupération moyenne d’une dilution de 1:2 était de 113 % pour le plasma avec héparine de lithium, les taux de récupérations étant compris entre 107 % et 117 %.

Le test PrognostiX CardioMPOMC est formulé pour tenir compte des effets de matrice liés à un échantillon de plasma humain de 10 μl. PrognostiX ne recommande pas de diluer davantage les échantillons. Les échantillons dont les taux de MPO dépassent la valeur du calibrateur le plus élevé doivent être signalés comme étant supérieur à cette valeur, par exemple, > 8 000 pmol/l. Cependant, une dilution de 1:2 utilisant du matériel de laboratoire en polypropylène peut être effectuée en sachant que la concentration de MPO obtenue de cette mesure sera ~13 % supérieure à sa valeur réelle.

46

Réactivité croisée

Les réactifs pouvant faire l’objet de réaction croisée cités au tableau suivant ont été testé dans du plasma traité à l’héparine de lithium, conformément à la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLIS). Toutes les protéines étudiées, ajoutées à un regroupement de plasma traité à l’héparine de lithium, ont présenté une réactivité croisée inférieure à 0,007 % lors que la concentration du test était élevé, et inférieure à 1,7 % lorsque la concentration du test était faible.

Substance testée

Concentrations testées (nmol/l)

α-1 antitrypsine humaine

1 250; 125; 12,5

Protéine C-réactive humaine

543; 54,3; 5,43

Lysozyme humain

4 464; 446,4; 44,64

IgA humaine

417; 41,7; 4,17

Élastase humaine

2 500; 250; 25

Peroxydase éosinophile humaine

887; 88,7; 8,87

Lactoperoxydase bovine

801; 80,1; 8,01

Lactoferrine humaine

781; 78,1; 7,81

COX1 ovin

893; 89,3; 8,93

COX2 humain

868; 86,8; 8,68

Peroxydase thyroïde humaine

595; 59,5; 5,95

Troponine I humaine

2 155; 215,5; 21,55

47

Substances interférentes

Les substances figurant dans le tableau suivant, qui ont été testées dans du plasma contenant 3 000 pmol/l et 1 000 pmol/l de MPO selon la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLS), n’étaient pas interférentes, et ce, jusqu’aux concentrations indiquées. Une erreur systématique de 10 % ou moins n’était pas considérée comme interférente.

Substance testée

Concentrations testées (nmol/l)

Remarques

Acide acétylsalicylique

600

Dose toxique

Albumine

50 000

Taux levé*

Amoxicilline

75

3 × dose thérapeutique

Bilirubine conjuguée

50

Taux levé*

Bilirubine non conjuguée

150

Taux levé*

Captopril

5

Dose toxique

Céruloplamine

600

Taux levé*

Cholestérol

1 000

Taux levé*

ADN

16,7

Taux levé*

Fénofibrate

45

3 × dose thérapeutique

Hémoglobine

5 000

Hémolyse*

Héparine, lithium

3 000 U/L

3 × dose thérapeutique

Hydrochlorothiazide

6

3 × dose thérapeutique

Hydrocortisone

0,69

Dose toxique

Ibuprofène

500

Dose toxique

Indométhacine

36

2 × dose thérapeutique

Dinitrate d’isosorbide

0,15

3 × dose thérapeutique

Lovastatine

53

2 × dose thérapeutique

Méthotrexate

160

Dose thérapeutique

Métoprolol

5

Dose toxique

Naproxène

500

4 × dose thérapeutique

Niacine

0,5

5 × dose thérapeutique

Nifédipine

0,4

2 × dose thérapeutique

Acide salicylique

600

Dose toxique

Azide de sodium

0,50 %

5 × dose de conservation

Triglycérides

5 000

Lipémie

* Taux élevé de substance interférente selon la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLS)

Effet de crochet

Il n’y a aucun signe d’effet de crochet jusqu’à 1 μmol/l de MPO, environ 100 fois de plus que la limite supérieure de la plage de résultats possibles, et 600 fois plus que le taux médian des patients de l’étude clinique, pour ce qui est du test CardioMPOMC.

48

Anticorps interférents

Vingt échantillons contenant des taux élevés d’anticorps humains anti-souris (HAMA) ou de facteur rhumatoïde (FR) ont été analysés dans le cadre du test des interférences avec le test CardioMPOMC. Le taux moyen de récupération de MPO dans ces échantillons était de 100 %, les taux individuels de récupération étant compris entre 96 % et 109 %. Dix échantillons contenant des anticorps anti-MPO p-ANCA avaient un taux moyen de récupération de 40 %, les taux individuels de récupération étant compris entre 37 % et 43 %. Par conséquent, aucune indication d’interférence significative n’a été observée avec les HAMA ou le FR; les taux apparents de MPO peuvent toutefois diminuer en présence d’anticorps anti-MPO p-ANCA.

ÉTUDE CLINIQUE

Pour déterminer la valeur prédictive du test PrognostiX CardioMPOMC quant au risque d’événements cardiaques indésirables majeurs, les taux de MPO ont été mesurés dans 560 échantillons de plasma provenant d’une étude antérieure ayant porté sur des patients arrivés au service d’urgence dans les 24 heures suivant la survenue des douleurs thoraciques2. Les participants ont été suivis pour surveiller l’apparition d’infarctus du myocarde, du besoin de revascularisation (pontage coronarien, intervention coronaire percutanée ou cathétérisme avec sténose de plus de 70 % d’au moins deux vaisseaux coronaires majeurs), ou du décès au cours des six mois suivants. Les échantillons dosés avec le test CardioMPOMC provenaient de patients âgés de 23 à 96 ans, dont l’âge médian était de 64 ans. Le diagnostic clinique a été établi tel que décrit précédemment7. L’incidence d’événements cardiaques indésirables majeurs (ÉCIM) a été évaluée par un suivi téléphonique 30 jours puis 6 mois plus tard.

Des modèles de régression logistiques à plusieurs variables (version SAS 8.0, SAS Institute) ont été établis pour calculer les risques relatifs approchés et les intervalles de confiance à 95 %. Les covariables ajustées comprenaient l’âge, le sexe, l’appartenance ethnique, le taux de troponine T (≤ 0,03 ng/ml vs > 0,03 ng/ml)7, le taux de protéine C-réactive (< 1 mg/l, 1-3 mg/l, > 3 mg/l)2, le taux de CK-MB (≤ 8,8 ng/ml vs > 8,8 ng/ml)7, les antécédents de tabagisme, les antécédents de diabète, les antécédents d’hypertension et les antécédents d’hypercholestérolémie. Des informations au sujet de covariables manquantes sur certains sujets ont réduit la population de l’étude. Le risque d’ÉCIM chez tous les patients pendant la période suivante de 30 jours a augmenté proportionnellement aux quartiles des taux de myéloperoxydase.

Une analyse semblable portant sur des patients présentant des taux constamment négatifs de troponine T (≤ 0,03 ng/ml) a révélé également un risque significativement plus élevé d’ÉCIM chez les patients dont les taux plasmatiques de MPO se situaient dans les quartiles plus élevés. Les risques relatifs approchés ajustés et le pourcentage de patients séparés par un quartile de MPO, présentant ou pas des ÉCIM à 30 jours sont indiqués aux graphiques et tableaux suivants.

49

Risque d’ECIM chez tous les patients

ÉCIM à 30 jours, tous les patients (n = 523)

Taux de MPO (pmol/l)

<1 151

1 151-1 879

1 880-2 953

>2 953

Risque relatif approché

1,0

2,5

2,8

3,3

IC à 95 %

S/O

1,3-4,8

1,5-5,6

1,7- 6,4

valeur p

p = 0,007

p = 0,0021

p < 0,001

*Dans chaque analyse, le premier quartile a servi de groupe de référence

Risque dÉCIM chez les patients présentant constamment des tauxnégatifs de troponine T

ÉCIM à 30 jours, patients présentant des taux négatifs de TnT (n = 523)

Taux de MPO (pmol/l)

<1 151

1 151-1 879

1 880-2 953

>2 953

Risque relatif approché

1,0

3,4

4,1

6,9

IC à 95 %

S/O

1,2-9,4

1,5-11,4

2,5-19,2

valeur p

p = 0,0194

p = 0,007

p < 0,001

*Dans chaque analyse, le premier quartile a servi de groupe de référence

Notons qu’il conviendrait d’avoir différentes valeurs seuils en fonction de chaque

population clinique.

100

Patients par quartile (%)

90

80

70

60

ECIM

50

Non ECIM

40

30

20

0

10

<1 151

1 151-1 879

1 880-2 953

>2 953

MPO par quartile (pmol/l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Patients par quartile (%)

ECIM

Non ECIM

<1 151

1 151-1 879

1 880-2 953

>2 953

MPO par quartile (pmol/l)

50

RÉFÉRENCES 1. Klebanoff SJ et al. Methods Enzymol 1984; 105: 399-403.

et al. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

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-874.

, PA.

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3. Hazen, SL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004: 24(7): 1143

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7. McErlean, ES et al. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

GARANTIE

Ce produit est garanti pour l’usage qui est décrit sur sa documentation officielle

et dans la documentation de Progn r ce produit, à condition qu’il soit

ostix, Inc. su

utilisé conformément aux directivepubliées. Prognostix, Inc. exclut s d’utilisation toute garantie, expresse ou implicite, et DÉCLINE TOUTE GARANTIE IMPLICITE DE QUALITÉ MARCHANDE OU D’APTITUDE À UN BUT PARTICULIER. DANS AUCUNE CIRCONSTANCE, QUELLE QU’ELLE SOIT, PROGNOSTIX, INC. NE SERA TENU RESPONSABLE DE TOUT DOMMAGE INDIRECT, SPÉCIAL OU CONSÉCUTIF.

Fabriqué pour :nostiX, Inc.

Prog

e Avenue, Clev

Tél : 1 866 358 7469 (PGNX)

R

Emergo Europe

Tél : +31 (0)70 345 8570

Fax : +31 (0)70 346 7299

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CardioMPOMC est une marque commerciale en instance de PrognostiX, Inc.

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10265 Carnegi

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c. : (216) 444-53

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eprésentant autorisé :

Molenstraat 15 2513 BH, La Haye

Pays-Bas

EC REP

51

MC

CardioMPO

Kit de réactifs pour dosage

immunoenzymatique

Numéro de catalogue : 7501

Guide de référence pratique PROGNOSTIX CardioMPOMC

1. Attendre au moins 30 minutes pour que les réactifs, les calibrateurs, les

contrôles et les échantillons de patient aient atteint la température ambiante

(20 à 26 °C) avant de les utiliser.

2. Passer les calibrateurs, les contrôles et les échantillons au vortex pour bien

les mélanger.

3. Pipetter 100 μl de chaque calibrateur CardioMPOMC dans les puits de

microtitrage appropriés.

4. Pipetter 90 μl de tampon de dosage dans tous les puits de microtitrage

d’échantillon et de contrôle.

5. Pipetter 10 μl d’échantillon de patient ou de contrôles CardioMPOMC dans les

puits de microtitrage appropriés.

6. Sceller et incuber pendant 45 minutes, en faisant tourner à 500 tr/min.

7. Laver 4 fois avec 400 μl de tampon de lavage et tapoter contre du papier

absorbant pour retirer l’excès de tampon.

8. Ajouter 100 μl de conjugué d’anticorps anti-MPO (jaune) dans chaque puits.

9. Sceller et incuber pendant 45 minutes, en faisant tourner à 500 tr/min.

10. Laver 4 fois avec 400 μl de tampon de lavage et tapoter contre du papier

absorbant pour retirer l’excès de tampon.

11. Ajouter 100 μl de réactif de substrat TMB dans chaque puits.

12. Incuber pendant 15 minutes, en faisant tourner à 500 tr/min.

13. Ajouter 100 μl de solution d’arrêt à chaque puits et tourner pour mélanger.

14. Lire l’absorbance à 450 nm, préférablement avec une correction à 630 nm.

Carte pour microplaque PROGNOSTIX CardioMPOMC recommande

Les calibrateurs et les contrôles peuvent devoir être positionnés différemment

selon le nombre d’échantillons dosés.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A CAL A 2 6 9 13 17 20 24 28 CTL3 35 39

B CAL B 3 7 10 14 18 21 25 29 CTL3 36 40

C CAL C 3 CTL1 10 14 18 21 25 29 32 36 40

D CAL D 4 CTL1 11 15 19 22 26 30 33 37 CAL A

E CAL E 4 7 11 15 19 22 26 30 33 37 CAL B

F 1 5 8 12 16 20 23 27 31 34 38 CAL C

G 1 5 8 12 16 CTL2 23 27 31 34 38 CAL D

H 2 6 9 13 17 CTL2 24 28 32 35 39 CAL E

52

Cardio MPOTM

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

VERWENDUNGSZWEC

quantitativen

er

klini

Patie en, bei denen das Risiko eines schweren

Reva nd Tod, besteht.

ung

von n Arbeiten lässt sich schließen, dass das

arth gt ist und zur Plaquevulnerabilität

wäh yndrom entnommen wurden,

gnisses

wendigkeit

TESTPRINZIP

D C O™ eag ien- ist En imm as -T na

Sandwichmetho zur tim g MPO nzentratio H np D

Cardio ll- CardioMPO™ Kalibratorm

e ioM ™ n -K stim , we n a se t g ert,

um eine effizien Ve ng d H hab zu äh ste

K

Der CardioMPO™ Reagenzien-Kit ist ein Enzymimmunoassay zur

Bestimmung von Myeloperoxidase in Humanplasma, das in Kombination mit dschen Vorgeschichte, EKG und kardialen Biomarkern herangezogen wird, um nten mit Thoraxschmerz auszuwert

kardiovaskulären Ereignisses, einschließlich Myokardinfarkt, Notwendigkeit einer skularisierung u

ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG

Die Aktivierung von Leukozyten stimuliert die Sekretion von MPO und die Bild Oxidantien1. Aus verschiedene

Enzym Myeloperoxidase (MPO), das von den Leukozyten sezerniert wird, an der erosklerotischen Progression beteili2.3

beiträgt. MPO wurde mit der Entwicklung folgender Ereignisse assoziiert:

Entwicklung fettreicher weicher Plaque, Aktivierung von Protease-Kaskaden, diedie Stabilität und Thrombogenizität von Plaques beeinträchtigen, Bildung toxischer und prothrombogener oxidierter Li

zytopide und Verbrauch von Stickoxid, was zur Vasokonstriktion führt3.

Die MPO-Konzentration in Plasmaproben von Patienten, die im Notdienst rend der Untersuchung auf akutes Koronars

gibt Auskunft über das Risiko eines schweren kardiovaskulären Erei

(major adverse cardiac events, MACE), wie z.B. Myokardinfarkt, Not

einer Revaskularisierung oder Tod, für den Zeitraum der nächsten 30 Tage und 6 Monate2. Das Risikoverhältnis (Odds-Ratio) für MACE steigt in allen Quartilen

der Population mit steigenden MPO-Plasmaspiegeln an. Die Vorhersagekraft der

MPO-Konzentration ist unabhängig von Alter, Geschlecht, Rasse, CPR-Stufe,

Troponin-T-Spiegel, CK-MB-Spiegel, anamnestisch Diabetes, Raucher, Hyperlipidämie und Hypertonie.

er

ardioMP

R

enz

Kit

eine

zym

uno

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ch der

de

Bes

mun

der

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uma

lasma.auch

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MPO™ Kom Card

ntroPO

Kit und der Reage

Kit sind zum Gebber

relief

it d

zien

it be

mt

rde

para

te

rpacku

un

and

ung

gew

rlei

n. 53

Der CardioMPO™ Kalibrator-Ki n (A-E) zum Gebrauch mit

dem CardioMPO™ Reagezien- n alibratorwerte sind den

jeweilig

gebrauc

er CardioMPO™ Kontroll-Kit enthält 3 Kontrollen (1-3), ebenfalls zum Gebrauch

zien-Kit. Die tatsächlichen Konzentrationsbereiche

ligen Kontrollen zu entnehmen. Kontrollen werden in

erden dann mit Waschpuffer gewaschen

isierten Antikörper gebunden

sind, zu entfernen.

uf der

amethylbenzidin (TMB) zugegeben

llen

ND MATERIALIEN

t enthält 5 KalibratoreKit. Die tatsächliche K

en Kalibratoretiketten zu entnehmen. Kalibratoren werden hsfertig geliefert.

D

mit dem CardioMPO™ Reagesind den Etiketten der jewei

der gleichen Weise wie Patientenproben verarbeitet. Kalibratoren werden den entsprechenden Kavitäten in der Mikrotiterplatte direkt zugefügt. Zu allen Kavitäten, die zur Analyse der Kontrollen und Proben bestimmt sind, wird Assaypuffer gegeben. Aliquoten der Kontrollen oder Proben werden in die entsprechenden Kavitäten gegeben und die Platte wird 45 Minuten bei 20-26 °C inkubiert. Die Kavitäten w

um Antigene, die nicht spezifisch an den immobil

Nun wird in jede Vertiefung ein Anti-MPO monoklonaler Antikörper, der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) markiert ist, gegeben und 45 Minuten bei 20-26 °C inkubiert. Dieser konjugierte Antikörper bindet an die MPO, die aPlatte eingefangen ist und die MPO in der Probe wird sandwichartig zwischendem Antikörper in der Festphase und dem Antiköperkonjugat gebunden. Die Platte wird erneut mit Waschpuffer gewaschen, um ungebundenen HRP-markierten Antiköper zu entfernen. Nun wird jeder Vertiefung das Substrat, Tetr

und für 15 Minuten bei 20-26 °C inkubiert, wobei sich eine blaue Farbe entwickelt. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe einer Stop-Lösung angehalten und die Farbe schlägt nach gelb um. Die enzymatische Umsetzung des Substrats wird spektrophotometrisch bei 450 nm, vorzugsweise mit Korrektur bei 630 nm, bestimmt und ist der MPO-Konzentration direkt proportional. Mit Hilfe der Absorptionen der Kalibratoren wird durch Auftragen der Absorptionen gegen die MPO-Konzentration eine Kalibrationskurve erstellt, mit der sich die MPO-Konzentrationen in den Kontrooder Proben ermitteln lassen.

REAGENZIEN U

Zum Lieferumfang des Kits gehörende Materialien: Mikrotiterplatte, beschichtet mit Anti-MPO-Antikörper, Platte mit 96 Kavitäten Mikrotiterplatte, beschichtet mit monoklonalem Mausantikörper, der für MPOspezifisch ist, 12 x 8 Kavitäten-Streifen 54

Assaypuffer, 100 ml Mit Citrat gepufferte Kochsalzlösung, die Detergentien und Zusatzstoffe enthält. Anti-MPO Antikörperkonjugat, 13 ml, gelbe Farbe

nd Wasserstoffperoxid.

ler, 2

Detergenzien. und Stabilisatoren. Die

0,5 ml

n für Volumen zwischen 10 μl und 1000 μl

tes Wasser

Messzylinder

Mikroplattenleser mit Ablesbarkeit bei 450 nm, vorzugsweise mit Korrektur

bei 630 nm

Computer Software, mit der durch entsprechende Kurvenanpassung die

MPO-Konzentration aus der optischen Dichte der Kalibratoren berechnet

werden kann (optional).

Koordinatenpapier zur manuellen Datenauswertung (optional).

Gelbe Lösung eines für MPO spezifischen HRP-konjugierten monoklonalen Mausantiköpers. TMB Substratreagenz, 13 ml Lösung von 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB) u

VOR LÄNGERER LICHTEINWIRKUNG SCHÜTZENStop-Lösung, 13 ml wässrige Schwefelsäurelösung (0,4 N). Dicht verschlossen halten. VORSICHT: REIZEND. 25 X Waschpufferkonzentrate, 40 ml Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Detergentien. Plattenversieg

Beutelversiegler, 1 Benötigte, aber nicht mitgelieferte Materialien: CardioMPO™ Kalibrator-Kit, 5 MPO-Konzentrationen (A-E), je 1,1 ml Kat. Nummer 9601 MPO in Phosphatpuffer mit Proteinen,

tatsächlichen Konzentrationen sind den jeweiligen Kalibrator-Etiketten zu entnehmen. CardioMPO™ Kontroll-Kit, 3 MPO-Konzentrationen (1-3), jeKat. Nummer 8601

MPO in humanem Lithium-Heparin-Plasma. Die tatsächlichen Konzentrationsbereiche sind den jeweiligen Etiketten der Kontrollen zu entnehmen. VORSICHT: ENTHÄLT MATERIALIEN HUMANEN URSPRUNGS. ALS POTENTIELL INFEKTIÖS ZU BEHANDELN. Einkanal- und Mehrkanal-Präzisionspipettoren mit Einmal-Polypropylenpipettenspitze

Typ I-Deinonisiertes oder Destillier

Vortex-Mischer oder äquivalentes Gerät

Orbital-Mikroplattenschüttler mit einer Drehzahl von 500 U/min (rpm)

Absorbierende Papiertücher Mikroplattenwaschgerät

55

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN

nz enthält 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB).

er spülen.

ofort mit reichlich Wasser spülen und sofort

autkontakt den

rt mit Seife und Wasser spülen. Bei Exposition der

ich Wasser spülen und sofort ärztliche Hilfe aufsuchen.

Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht verwenden.

ontrollen mitführen. Falls die Werte der Kontrollen nicht

i

AG

Ung

Verf

werd i

m auf dem Etikett

ge ung,

eit aufweisen, nicht benutzen.

O ME UND LAGERUNG

t lröhrchen mit Hilfe von aseptischen

kopfdrehen gründlich mischen. Lithiumauf

2-8 °C gebracht werden und bis

fbewahrt werden. Plasma muss unter

Zent en Zellen abgetrennt werden. Nach CLSI (ehemals NCCLS)-

e p

20-2 nnen die Assays innerhalb von 8 Stunden nicht

rt werden.

Zum Gebrauch in der In-vitro-Diagnostik.

Nur zum Professionellen Gebrauch.

Alle Plasmaproben müssen wie potentiell infektiöses Material behandelt werden.

Es muss eine sachgemäße Handhabung und Entsorgung gemäß den örtlichen, staatlichen und Bundesvorschriften erfolgen.

Das TMB-Substratreage

Bei Hautkontakt den betroffenen Bereich sofort mit Seife und WassBei Exposition der Augen s

ärztliche Hilfe aufsuchen.

Die Stop-Lösung enthält 0,4 N Schwefelsäure. Bei H

betroffenen Bereich sofo

Augen sofort mit reichl

Mikrotiter-Kavitäten nicht wiederverwenden.

Bestandteile anderer Chargen des CardioMPO™ Reagenzien-Kits nicht vermischen.

Die Kontrollen sind im Kit nicht enthalten, können jedoch separat bestellt werden (Kat. Nr. 8601). Bei jedem Durchlauf von Patientenproben die CardioMPO™-K

nnerhalb akzeptabler Grenzen liegen, ist der Assay zu wiederholen. ERUNG DER REAGEN

LZIEN eöffnete Test-Kits müssen nach Erhalt gekühlt bei (2-8 °C) bis zum allsdatum gelagert werden. Nicht gebrauchte Mikrotiter-Kavitäten-Streifen en mit Trockenmittel versiegelt im Folienbeutel bei 2-8 °C gelagert. Be

Lagerung gemäß Anleitung bleiben ungeöffnete Test-Kits bis zuangebenen Verfallsdatum stabil. Reagenzien, die Anzeichen einer Verfärb

Trübung, eines Niederschlags oder einer Undichtigk

PRBENENTNAH

Bluproben sollten in Lithium-Heparin-Samme

Venenpunktionsmethoden entnommen werden. Um akkurate Ergebnisse zu

gewährleisten, Proben durch über

Heparin-Proben müssen sofort auf Eis oderzur Auftrennung bei 2-8 °C au

Zuhilfenahme einer Standardabtrennmethode, vorzugsweise in einer gekühlten rifuge, von d

Richtlinien5 wird eine maximale Zeitdauer von 2 Stunden nach Entnahme mfohlen. Plasma darf nach der Abtrennung nicht länger als 8 Stunden bei 6 °C aufbewahrt werden. Kö

abgeschlossen werden, muss das Plasma gekühlt (2 bis 8 °C) gelage

56

CardioMPO™-Plasmaspiegel sind nachweislich bei 2-8° C 8 Tage stabil. Sind die

abgetrennte Plasma

asma eingefroren bei -15°C oder

nicht wiederholt eingefroren und

aufgetaut werden, da sich dabei der Analyt zersetzen kann. CardioMPO™-

Verf

Assays nach 8 Tagen nicht abgeschlossen oder muss das länger als 8 Tage aufbewahrt werden, ist das Pl

darunter zu lagern. Plasmaproben dürfen

Plasmaspiegel sind nachweislich über 2 Einfrier-/Auftauzyklen stabil.

TESTVERFAHREN ahrenshinweise

1. eagenzien, Proben, Kalibratoren und Kontrollen vor Gebrauch für indestens 30 Minuten auf Raumtemperatur (20–26 °C) bringen. roben, Kalibratoren und Kontrollen durch Vortexen gründlich vermischen.ng vermeiden. Rm

2. P

Schaumbildu

W

S

MS

l zurücklegen,

w

F e

P en.

Alle Kalibratore

g

6. V enz

itäten

n Waschpuffers können zu

isse führen.

folgendem Verfahren hergestellt.

1X Zubereitung des Gebrauchswaschpuffers

3. enn die Platte Raumtemperatur (20–26 °C) erreicht hat, den Kavitäten-treifenrahmen entfernen und die benötigte Anzahl beschichteter ikrotiterstreifen aus dem Folienbeutel entnehmen. Nicht benutzte Kavitäten-

treifen in den Folienbeutel mit darin enthaltenem Trockenmitte

ieder versiegeln und bei 2-8 ºC aufbewahren.

4.ür jedes Reagenz, jeden Kalibrator, jede Kontrolle oder Probe eine neuolypropylen-Pipettenspitze verwenden, um Kontaminierung zu vermeid

5. n, Kontrollen und Proben sollten als Doppelbestimmung emessen werden. or dem Zusatz von Anti-MPO-Antikörperkonjugat und TMB-Substratreagdarauf achten, dass sich keine Reste von Waschpuffer mehr in den Kav

befinden. Kleinste Mengen noch anwesendeVeränderungen der Testergebn

7. Um genaue Messungen zu erzielen, muss die Zugabe der Proben, Kalibratoren und Kontrollen sehr präzise erfolgen. Vorsichtig und nur mit kalibrierten Geräten pipettieren. 8. Alle Kit-Komponenten, außer dem Waschpufferkonzentrat, werden gebrauchsfertig geliefert. Die Lösung des Gebrauchswaschpuffers wird nach fferreste zu

Das Waschpufferkonzentrat vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20–26 °C) bringen. Für die Herstellung des Gebrauchswaschpuffers eine Flasche des mitgelieferten 25X Waschpufferkonzentrats in ein sauberes Ein-Liter-Gefäß gießen. Die Flasche mit Typ I-deionisiertem Wasser ausspülen, um Puentfernen und Kristalle aufzulösen. Die Spülflüssigkeit dazu gießen, mit Typ I-deionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1,0 Liter verdünnen und gut vermischen. Der 1X Gebrauchswaschpuffer ist bis zu zwei Monaten lang stabil, wenn er bei 2-8°C gelagert wird. 57

Plattenvorbereitung 1. 100 μl jedes CardioMPO™ Kalibrators in die entsprechenden Kavitäten der beschichteten Mikrotiterplatte geben. 2. 90 μl des Assay-Puffers in die entsprechenden Kavitäten der beschichMikrotiterplatte geben, die für Proben und Kontrollen bestimmt

teten

sind.

ter Proben und Kontrollen in die entsprechenden

3. 10 μl gut gemisch

Kavitäten pipettieren.

Probeninkubation Platte mit dem mitgelieferten Plattenversiegler versiegeln und auf e 1. inem

l

g

3.

bklopfen. Die Kavitäten

Ant

Plattenschüttler bei 500 U/min (rpm) 45 Minuten bei Raumtemperatur (20-26 °C) inkubieren.

2. Am Ende der Inkubationsperiode die Mikrotiterkavitäten vier Mal mit 400 μdes Gebrauchswaschpuffers waschen. Nach dem letzten Waschvorgandie Kavitäten aspirieren. Zur Enfernung jeglicher Reste von Waschpuffer die Platte nach dem letzten Waschschritt auf absorbierenden Papiertüchern a

nicht austrocknen lassen. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren. ikörperkonjugat-Inkubation

1. In jede Kavität 100 μl Anti-MPO Antikörperkonjugat pipettieren. Platte mit dem mitge 2. lieferten Plattenversiegler versiegeln und auf einem

3. 0 μl

ch dem letzten Waschvorgang

4. n

apiertüchern abklopfen. Die Kavitäten

.

Sub

Plattenschüttler bei 500 U/min (rpm) 45 Minuten bei Raumtemperatur (20-26°C) inkubieren. Am Ende der Inkubationsperoiode die Mikrotiterkavitäten vier Mal mit 40des Gebrauchswaschpuffers waschen. Na

die Kavitäten aspirieren. Zur Enfernung jeglicher Reste von Waschpuffer die Platte nach dem letzteWaschschritt auf absorbierenden P

nicht austrocknen lassen. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahrenstratinkubation und Farbentwicklung

1. 100 μl TMB Substratreagenz in jede Kavität pipettieren.

2. Auf einem Plattenschüttler bei 500 U/min (rpm) bei Raumtemperatur (20-26 °C) inkubieren. Anhalten und Ablesen

15 Minuten

1. Die Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stop-Lösung in jede Kavität anhalten. 2. Durch vorsichtiges Schwenken der Platte auf flacher Oberfläche vermischen. Sicherstellen, dass die blaue Farbe vollständig nach gelb umschlägt. 3. Die optische Dichte bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät ablesen.

Eine Hintergrundkorrektur bei 630 nm wird empfohlen.

58

BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

g mit vier Parametern empfohlen.

pmol/l aus der Kalibrationskurve

PO-Konzentration, die jedem Kalibrator zugewiesen ist,

in

3. rationen, die über dem höchsten Kalibratorwert

e

1. Mit Hilfe der entsprechenden Computer Software eine Kalibrationskurve erstellen. Es wird eine Kurvenanpassun

Manuelle Berechnungen können durch Auftragen der für jeden Kalibrator erhaltenen mittleren Absorption auf der y-Achse gegen die MPO-Konzentration (pmol/l) auf der x-Achse vorgenommen werden.

2. Mit Hilfe des mittleren Absorptionswertes für jede Probe und Kontrolle wird die entsprechende MPO-Konzentration in

ermittelt. Die M

entspricht dem Gebrauch einer Probenmenge von 10 μl (1:10 Verdünnungder Platte), so dass keine weiteren Berechnungen notwendig sind. Proben mit MPO-Konzent

liegen, werden als höher als dieser Wert angegeben, z.B. > 8000 pmol/l. Einweitere Probenverdünnung wird nicht empfohlen. 59

BEISPIEL EINER KALIBRATIONSKURVE

er

ionskurve

Zweck der

Die Ergebnisse einer typischen Kalibrationskurve zeigen die abgelesenenO.D.-Werte bei 450nm mit Korrektur bei 630 nm auf der y-Achse, aufgetragen gegen die MPO-Konzentrationen (pmol/l) auf der x-Achse. DBenutzer sollte für jeden durchgeführten Test eine neue Kalibraterstellen. Die folgende Kalibrationskurve dient ausschließlich dem

Veranschaulichung. Kalibrator MPO Level (pmol/l) Mittlere Absorption (O.D. bei 450 nm, Korrektur bei 630 nm) A 8020 2,630

B 3650 2,000 C 1580 1,108 D 490 0,346

E 0 0,031

Kalibrationskurve

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

Konzentration (pmol/l)

OD

60

BESCHRÄNKUNGEN

Verf

ahren Verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse sind nur durch sorgfältige Einhaltung der in dieser Packungsbeilage beschriebenen Vorgehensweisen und Befolgung der Sicherheitsbestimmungen Ihres Labors gewährleist. Dabei sind die Wasch

schritte äußerst wichtig. Unzureichendes Waschen

führt zu schlechter Präzision und falsch erhöhten o

Absorptionsme

Wie bei jedem Assay mit Tie n best it

einer Interf z durch hetero ntikörper wie hum i-

Mausantikö (HAMA), deren Anwesenheit in Proben z erhöhten

oder falsch erniedrigten Werten führen könnte.

Andere Fak n, einschließlich technischer Fehler oder rensfehler,

können mit CardioMPOTest interferieren und zu n Ergebnissen

führen.

der erniedrigten

sswerten.

rantikörper

eht auch hier die Möglichke

eren

phile A

ane Ant

rper

u falsch

tore

Verfah

dem

falsche

Klinische Interpretation MPO-Konzentrationen sind zusammen mit klinischen Ergebnissen und anderen diagnostischen Tests zu interpretieren. Dieser Test dient nicht als Ersatz für andere traditionelle Risikofaktoren für die koronare Herzkrankheit wie z.B. EKG, klinische Vorgeschichte, Marker für myokardiale Nekrose usw. ERWARTETE WERTE Plasmaproben von Männern (n=150) und Frauen (n=150) aus einer Gruppe offensichtlich gesunder Blutspender wurden mit dem CardioMPO™ Test bestimmt. Mit Hilfe eines Zwei-Stufen-Schemas zur Detektion von Ausreißern, einer Box-Cox-Transformation und nachfolgender robuster Ausreißerdetektionsmethode wurden sieben Ausreißer eliminiert.6 Da zwischen den MPO-Konzentrationen keine geschlechtsabhängigen Unterschiede auftraten, wurde der Referenzbereich nach Korrektur für die Ausreißer basierend auf der gesamten Bevölkerungsgruppe abgeschätzt. Der mittlere MPO-Spiegel für Probanden in der angepassten Datenbank war 340 pmol/l und die Ergebnisse lagen im Bereich von 137 bis 984 pmol/l. Die non-

parametrische Verteilung der Myeloperoxidase-Konzentrationen in dieser

normalen Population ergibt nach der Eliminierung von Ausreißern ein zweiseitiges

zentrales 95% Referenzintervall von 156 – 734 pmol/l. Das bei dieser Applikation

eher angebrachte einseitige untere Referenzinterval ist jedoch ebenso nach

Eliminierung der Ausreißer < 640 pmol/l.

61

LEISTUNGSMERKMALE

keit

Empfindlich

ei

Stan )

bere

Die untere Nachweisgrenze, die durch Interpolation des Mittelwertes plus zwdardabweichungen von 26 Wiederholungen des 0 pmol/l MPO-Kalibrators (Echnet wurde, ist 14 pmol/l MPO.

Assay-Präzision ion wurden bestimmt, indem 6 Lithium- Die Gesamt- sowie die Intra-Assay-Präzis

Heparin-Plasmatestproben mit über den gesamten Kalibrationsbereich des Assays

NCC timmung

unte i

sepa jede Platte wurde eine

: Zusammenfassung der Ergebnisse der Präzisionsstudie

Test MPO – Intra-

% VK

verteilten MPO-Konzentrationen nach den Vorschriften des CLSI (ehemals LS) EP5-A getestet wurden. Diese Proben wurden als Doppelbesr Verwendung einer einzigen Reagenzien- und Kalibratorencharge auf zweraten Platten pro Tag 20 Tage lang getestet. Für

Kalibrationskurve durch Doppelbestimmung erstellt. Die folgende Tabelle fasst die Ergebnisse der Präzisionsstudie zusammen. Tabelle 4

Probenbezeichnung Konzentration (pmol/l) Anzahl WiederholungenGesamt % VK Assay

L

ithium-Heparin-Plasma Probe 1 307 80 10,2% 5,8%

L

Plasma Pro 0 80 5,8% 5,0% ithium-Heparin-be 2 61

Lithium-Heparin-

Plasma Probe 3 1285 76* 7,4% 5,7%

Lithium-Heparin-Plasma Probe 4 1459 80 8,9% 8,6% Lithium-Heparin-Plasma Probe 5 2745 80 9,0% 9,0%

Lithium-Heparin-Plasma-Probe 6 4758 80 8,7% 6,4% Durchschnitt 8,3% 6,7%

* Die 1 Tag entsprechende Menge an Daten wurde wegen groben Ausreißern von der Analyse ausgeschlossen.

62

Linearität

Lithium-Heparin-Plasmaproben, die durch Versetzen mit MPO auf hohe MPOationen

in den Mischungen wurde mit

estimmung der Linearität gemäß den Empfehlungen in

-Richtlinie EP6-A ausgewertet. Die Linearität des

Konzentrationen gebracht wurden, wurden mit unverdünnten Plasmaproben niedriger MPO-Konzentration vermischt, um 9 MPO-Konzentrationen zu erhalten, die sich über den erwarteten linearen Bereich erstrecken und darüber hinaus gehen. Die Linearität der MPO-Konzentr

Hilfe der polynomialen Bder CLSI (ehemals NCCLS)

CardioMPO™-Tests in Lithium-Heparin-Plasma wurde nachgewiesen für den Bereich von 14 pmol/l bis 9410 pmol/l MPO, innerhalb von 60 pmol/l oder 6% in diesem Interval. Wiederfindung zugesetzter Mengen Neun Lithium-Heparin-Plasmaproben wurden zur Bestimmung der Wiederfindumit 497, 1456 und 2851 pmol/l MPO versetzt. Die prozentuale Wiederfindung wurde durch Division der mittleren gemessenen M

ng

PO-Konzentration der

ver

erw in

er unverdünnten Plasmaprobe und der Konzentration des MPO-Zusatzes

entsprach. Die durchschnittliche Wiederfindung ten M iu

rt

von 100,7 %.

Wiederfindung nach Verdünnu

setzten Probe durch die erwartete MPO-Konzentration errechnet, wobei die artete MPO-Konzentration der Summe der gemessenen MPO-Konzentration

d

zugesetzbis 117 % mit einem

POs in Lith Mittelwe

m-

Heparin-Plasma lag im B

ereich von 87 %

ng Ne n-Plasma n wurden mit 2851 pmol/l M setz

ans aypuffer 1:2, 1:4 und 1:8 verdünnt. Die prozentuale

W e durch D der mit dem Verdünnungs

multiplizierten mittleren MPO-Konzentration der vo ten Pro h die

mi tration d e ohne Vorverdünnung errechnet. Die

mittlere Wiederfindung einer 1 nnung war bei Lithium-Heparin-

Pla , wobei derfindungsw im Berei 107

117

un Lithium-Heparichließend mit Ass

probe

PO ver

t und

iederfindung wurd

ivision

faktor be durc

rverdünn

ttlere MPO-Konzen

er Prob:2 Verdü

smaproben 113 % % lagen.

die Wie

erte

ch von

% bis 63

Der PrognostiX CardioMPO™-Test ist so ausgelegt, dass mit einer 10 μl

Humanplasmaprobe verbundene Matrixeffekte berücksichtigt werden. PrognostiX empfiehlt keine weitere Probenverdünnung. Proben mit MPO-Konzentrationenoberhalb des Wertes für den höchsten Kalibrator sollten als größer als dieser Wert angegeben werden, z.B. > 8000 pmol/l. Eine 1:2 Verdünnung unter Verwendung von Polypropylen-Laborutensilien kann erfolgen, wenn dem Laboranten bekannt ist, dass die aus dieser Messung erhaltene MPO-Konzentration ~13 % höher als der tatsächliche Wert sein wird. Kreuzreaktivität Die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten potentiellen Kreuzreaktanten wurden den Vorschriften der CLSI (ehemals NCCLS)-Richtlinie EP7-A

ma und Assaypuffer getestet. Alle

entsprechend in Lithium-Heparin-Plas

geprüften Eiweiße zeigten nach Zugabe zu einem Lithium-Heparin-Plasmapool bei hoher Testkonzentration eine Kreuzreaktivität von weniger als 0,007 % und bei niedriger Testkonzentration eine Kreuzreaktivität von weniger als 1,7 %. Testsubstanz Testkonzentrationen (nmol/l) Humanes alpha-1-Antitrypsin 1250 125 12,5 humanes C-reaktives Protein 543 54,3 5,43 Humanes Lysozym 4464 446,4 44,64 Humanes IgA 417 41,7 4,17 Humane Elastase 2500 250 25

Humane Eosinophil-Peroxidase 887 88,7 8,87

Lactoperoxidase, Rind 801 80,1 8,01

Humanes Lactoferrin 781 78,1 7,81 COX1, Schaf 893 89,3 8,93 Humanes COX2 868 86,8 8,68 Humane Thyroid-Peroxidase 595 59,5 5,95 Humanes Troponin I 2155 215,5 21,55 64

Störsubstanzen Die in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Substanzen wurden entsprechend der CLSI (ehemals NCCLS)-Richtlinie EP7-A in Plasma mit 300pmol/l und 1000 pmol/l MPO auf Interferenz getestet und erwiesen sich bisden angegebenen Konzentrationen als nicht störend. Verzerrungen von 10oder weniger wurde nicht als Interferenz angesehen. 0

zu

%

stanz Testkonzentration

(mg/l) Anmerkungen

Testsub

Acetylsalicysäure 600 Toxische Dosis

Albumin 50000 Hoch

Amoxicillin 75 3 x therapeuische Dosis

Bilirubin, konjugiert 50 Hoch Bilirubin, nicht konjugiert 150 Hoch Captopril 5 Toxische Dosis Ceruloplasmin 600 Hoch

Cholesterin 1000 ch*

HoDNA 16,7 Hoch

Fenofibrat

45 che Dosis

3 x therapeuisHämoglobin 5000 Hämolyse*

Heparin-Lithium

3000 U/l ische Dosis

3 x therapeu

Hydrochlorthiazid 6 ische Dosis

3 x therapeuHydrocortison 0,69 Toxische Dosis

Ibuprofen 500 Toxische Dosis

Indomethacin

36 peutische

sis

2 x theraDo

Isosorbiddinitrat 0,15 ische Dosis

3 x therapeu

Lovastatin 53 eutische

s

2 x thera

pDosi

Methotrexat 160 Therapeutische Dosis

Metoprolol 5 Toxische Dosis

Naproxen 500 4x therapeutische Dosis

Niacin 0,5 5x therapeutische Dosis

Nifedipin 0,4 2 x therapeutische

Dosis

Salicylsäure 600 Toxische Dosis

Natriumazid 0,50% 5x Erhaltungsdosis

Triglyzeride 5000 Lipämie

* Hohe Konzentration an Störsubstanz nach CLSI (ehemals NCCLS) EP7-A

Hook-Effekt

Bis zu einer Konzentration von 1 μmol/l MPO, die ungefähr 100 mal höher ist als

das obere Ende des bestimmbaren Wertebereichs und 600mal höher als die

Mediankonzentration bei Patienten in der klinischen Studie, kann im CardioMPO™

Test kein Hook-Effekt nachgewiesen werden.

65

Störende Antikörper

pdie

gen. Folglich konnte keine

signifikante Interferenz aufgrun RF festgestellt werden;

scheinb rationen wese

p-ANCA-Antikörpern verringert sein.

K E STUDIE

Zur Bestimmung der Aussagekraft des Pro CardioMPO™ Tests bei der

A schweren ka skulären Ereignisse en die

Konzentrationen an 0 gelagerten us einer Studie mit

P erhalb von 24 Stunden n uftritt von Tho n

N pruch nahmen, analysier eilnehmer wurden e

f onate hinweg auf das Auftr ines Myokardinfarkt

Notwendigkeit einer Revaskularisierung (K rarterienb

p narintervention oder Kath rung mit ü

Stenose in mindestens zwei großen Herzkranzgefäßen) od

b dem CardioMPO™ lysierten

P n 23 bis 96 Jahren m m mittlere

k estellung erfolgte wie zu schrieben.7 Da

schwerer kardiovaskulärer Ereignisse wurde durch Nachsorgeanrufe, die nach

3 Monaten erfolgten, bewer

Z r Risikoverhältnisse (O s) und

V tervalle wurden multivariante tische Regres

Version 8.0, SAS Institute) entwickelt. Die angepassten Kovarianten waren Alter,

Geschlecht, Rasse, Troponin T (≤0,03 ng/ . >0,03 ng/

Protein (<1 mg/l, 1-3 mg/l, >3 mg/l)2, CK-M (≤8,8 ng/m vs.

anamnestisch Raucher, Diabetes, Hyperto d hoher C

Fehlen kovarianter Information über einige enten führ

S ion. Das MACE-Risiko nahm allen Patiente

nachfolgenden 30-tägigen Zeitperiode mit steigenden Quartilen der

Myeloperoxidasekonzentrationen zu.

Eine ähnliche Analyse von Patienten, die stets Troponin T-ne

ng/ml), zeigte bei Patienten mit MPO-Plas zentrationen in de

uartilen ebenfalls ein signifikant erhöhtes MACE-Risiko. Angepasste

und Tabellen dargestellt.

Zwanzig Proben mit bekanntlich erhöhten HAMA- oder RF-Spiegeln wurden aufeine Interferenz im CardioMPO™-Test getestet. Die mittlere Wiederfindung von MPO betrug in diesen Proben 100%, wobei die einzelnen Wiederfindungenzwischen 96% und 109% lagen. Bei zehn Proben, die bekanntlich anti-MPO ANCA-Antikörper enthielten, betrug die mittlere Wiederfindung 40%, wobei einzelnen Wiederfindungen zwischen 37% und 43% la

d von HAMA oder können jedoch bei An

are MPO-Konzent

nheit von anti-MPO

LINISCH

gnostiX

bschätzung des Risikos vonMPO in 56

rdiova

n wurd

Plasmaproben a

atienten, die innns

ach A2

raxschmerzen de

otdienst in Aen 6 M

t.Die T

über di

olgend

eten eoa

s, der

ron

ypassoperation, ber 70-prozentiger

erkutane Koro

eterisie

er einehin

s Todesfalls

eobachtet. Die mit r vo

Tena

st a

Proben stammten von n Al

atienten im Altelinische Dignos

it einevor be

ter von 64. Die s Auftreten

a

0 Tagen und 6

tet.

ur Berechnung de

dds-Ratio

der 95 %

ertrauensin

logis

sionsmodelle (SAS

ml vs

ml)7, C-reaktives

B

>8,8 ng/ml)7,

nie un

holesterinwert. Das

Pati

te zur Reduktion der

tudienpopulat

bei

n in der

gativ 0,03

waren (≤n oberen

makon

Q

Risikoverhältnisse (Odds-Ratios) und der Prozentsatz von Patienten innerhalb eines MPO-Quartils mit und ohne MACE nach 30 Tagen sind in den folgenden

Abbildungen

66

MACE-Risiko der gesamten Patientenpopulation

MACE nach 30 Tagen, alle Patienten (n=523) MPO (pmol/l) <1151 1151-1879 1880-2953 >2953

Odds-Ratio 1,0 2,5 2,8 3,3

95% KI kA 1,3-4,8 1,5-5,6 1,7- 6,4

p-Wert p = 0,007 p = 0,0021 p < 0,001 *Bei jeder Analyse diente das erste Quartil als Referenzgruppe MACE-Risiko bei stets Troponin T negativen Patienten

0

n inne

MACE nach 30 Tagen, TnT negative Patienten (n=304)

MPO (pmol/l) <1151 1151-1879 1880-2953 >2953

Odds-Ratio 1,0 3,4 4,1 6,9 95 % KI kA 1,2-9,4 1,5-11,4 2,5-19,2

p-Wert p = 0,0194 p = 0,007 p < 0,001

*Bei jeder Analyse diente das erste Quartil als Referenzgruppe

hingewiesen, dass die Cut-off-Punkte bei verschiedenen klinischen

pulationen unterschiedlich sein können.

Es wird darauf

Po

10 te

20 30 40 50 60 70 80 90 100 rhalb der Quartile (%) MACEKEIN MACE<11511151-18791880-2953>2953MPO nach Quartile(pmol/l)Patien

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 <11511151-1879188tienten innerhalb der Quartile (%)100MACEKEIN MACE

0-

2953

>2953

MPO nach Quartile(pmol/l)Pa

67

LITERATUR

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-874.

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tur für dieses Produkt beschriebenen Leistung

entspricht, wenn die cht n auch

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EINEN BESTIMMTEN ZWECK AB. PROGNOSTIX, INC HAFTET UNTER KEINEN

UMSTÄNDEN FÜR IRGENWELCHE INDIREKTEN, SPEZIELLEN ODER

FOLGESCH

ÄDEN WELCHER ART AUCH IMMER. Hergestellt für:

PrognostiX, Inc.

e Avenue, Cleveland, Ohio 44106

Tel: (866) 358-9828, (216) 445-7469 (PG

Fax: (216) 444-5335

info@prognostix.com

www.prognostix.com

ertre

Emergo Europa

2513 BH, Den Haag

l: + 5

e Marke der PrognostiX, Inc.

10265 Carnegi

NX)

Autorisie

rter V

ter:

Molenstraat 15 EC REP

Niederlande

Te

31 (0)70 345 8

70

Fax: +31 (0)70 346 7299

Dieses Produkt ist durch die US-Patentanmeldung 20020164662 geschützt. CardioMPO™ ist eine angemeldet

68

CardioMPO

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

vor Gebrauch

gen.

ischen.

rechenden

- und Kontrollen

pipettieren.

5. 10 μl Patientenprobe oder Ca trolle in die entsprechenden

n.

pipettieren.

12. 15 Minuten lang bei 500 U/min (rpm) rotierend inkubieren.

13. Jeder Kavität 100 μl Stop-Lösung z gen und durch vorsichtiges

Schwenken vermischen.

14. se mit Korrektur bei 630 nm, ablesen.

Empfohlenene Beleg der ardioMPO™

Mikrotiterplatt

Gegebenenfalls is eine andere

Anordnung der Kalibratoren un .

1 2 3 4 9 10 11 12

Bestellnummer: 7501

PROGNOSTIX CardioMPOKurzanleitung

1. Alle Reagenzien, Kalibratoren, Kontrollen und Patientenproben für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur (20–26°C) brin

2. Kalibratoren, Kontrollen und Proben durch Vortexen gründlich durchm

3. Je 100 μl von jedem CardioMPO™-Kalibrator in die entsp

Mikrotiterkavitäten pipettieren. 4. 90 μl Assaypuffer in alle Mikrotiterkavitäten für Proben

rdioMPO™-Kon

Mikrotiterkavitäten pipettieren. 6. Versiegeln und 45 Minuten lang bei 500 U/min (rpm) rotierend inkubieren. 7. 4 mal mit 400 μl Gebrauchswaschpuffer waschen und zur Entfernung überschüssigen Puffers abklopfen. 8. In jede Kavität 100 μl Anti-MPO Antikörperkonjugat (gelb) pipettieren. 9. Versiegeln und 45 Minuten land bei 500 U/min (rpm) rotierend inkubiere10. 4 mal mit 400 μl Gebrauchswaschpuffer waschen und zur Entfernung überschüssigen Puffers abklopfen. 11. 100 μl TMB Substratreagenz in jede Kavität

uDie Absorption bei 450 nm, vorzugsweiung

PROGNOSTIX C

e

t, je nach Anzahl der zu analysierenden Proben,

d Kontrollen zu wählen

5 6 7 8 A KAL A 2 6 9 13 17 20 24 28 KTL3 35 39

B KAL B

18 21 3 7 10

14 25 29 KTL3 36 40

C KAL C 3

KT

L1 10 14

18 21

25 29 32 36 40

D KAL D 4

KT

L1 11 15

19 22 26 30 33 37 KAL A

E KAL E 4 7 11

15 19 22 26 30 33 37 KAL B

F 1 5 8 12

16 20 23 27 31 34 38 KAL C

G 1 5 8 12 16 KTL2 23 27 31 34 38 KAL D

H 2 6 9 13 17 KTL2 24 28 32 35 39 KAL E

69

Cardio MPOTM Kit di reagenti per saggio immunoenzimatico

it

rischio

v

t

,

con aterosclerotica.2,3 L’enzima MPO è stato

,

ci e

prot nitrico, determinando vasocostrizione.3

ienti, durante il

una

e eventi

avversi cardiaci maggiori (MACE), cioè infarto miocardico, necessità di

e dei livelli

o,

PRINCIP E O

rd ™ n s immuno a

per la misurazione

della concentrazione di MPO nel plasma uma

PO de o e zat em kit a C P

vengono forniti separatamente per facilitare il confezionamento e la

Il kit di calibrazione C MPO™ contiene 5 calibratori (A a ar il

kit di reagenti CardioM . ori tivi tiv a ore in ti

su iche di o fi i c at ca or o iti p i al

USO PREVISTO

Il k di reagenti CardioMPO™ è un saggio immunoenzimatico destinato ad essere

utilizzato per la determinazione quantitativa della mieloperossidasi nel plasma umano. Va utilizzato unitamente all‘anamnesi, all’ECG e ai biomarcatori cardiaci

nella valutazione di pazienti che presentano dolore toracico e che sono a enti avversi cardiaci maggiori, ch

di ee includono l’infarto miocardico, la necessità di rivascolarizzazione o il decesso.

BREVE DESCRIZIONE E SPIEGAZIONE tivazione dei leucociti stimola la se

L'acrezione di MPO e la produzione di ossidanti.1 Numerose evidenze suggeriscono che l'enzima mieloperossidasi (MPO)

secreto dai leucociti, partecipi alla progressione del processo aterosclerotico e tribuisca alla vulnerabilità della placca

collegato allo sviluppo della placca soffice con prevalente componente lipidica

all'attivazione dei sistemi a cascata delle proteasi che influiscono sulla stabilità e

sulla trombogenicità della placca, sulla produzione di lipidi ossidati citotossirombogenici e sul consumo di ossido

La concentrazione plasmatica di MPO in campioni ottenuti da p

azperiodo in cui sono stati tenuti in osservazione al Pronto Soccorso

per sindrome coronaria acuta, ha consentito di predire il rischio di sviluppar

rivascolarizzazione o morte, nel periodo di tempo che va dai 30 giorni fino ai 6

mesi successivi.2L’ odds ratio per MACE aumenta con l’aumentarplasmatici di MPO in tutti i quartili della popolazione. Il valore predittivo della

concentrazione di MPO è indipendente da età, sesso, razza, livello di PCR, livello di troponina T, livello di CK-MB e da un’anamnesi positiva per diabete, tabagismiperlipidemia o ipertensione.

IO D

L SAGGI

Il kit di reagenti

Ca

ioMPO

è u

aggio

enzim

tico

4

no. I kit di controllo e di calibr

azione

CardioM

von

esser

utiliz

i insi

e al

di re

genti

ardioM

O™, ma

manipolazione.

ardio

-E) d

utilizz

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PO™

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librat

sono

dica

ll’et

tta

gni

ala d

alibr

ore. I

librat

i son

forn

ront

l’uso.

70

Il kit di controllo CardioMPO™ 3) da utilizzare con il kit di

reagenti CardioMPO™. Gli effe entrazione relativi ai controlli

ss

calibratori vengono aggiunti direttamente al pozzetto appropriato della

pone del test viene aggiunto a tutti i pozzetti che si intende

isi dei campioni o dei controlli. Si aggiunge un'aliquota di

di

cato

di incubare per 45 minuti a

all’MPO trattenuto sulla piastra, e

l'MPO contenuto nel campione viene ad essere “sandwiched” tra l’anticorpo

ente

del colore dal blu al giallo.

banza dei

con anticorpi anti-MPO, 96 pozzetti

o monoclonale murino specifico verso

colore giallo contenente un anticorpo monoclonale murino

idrogeno. PROTEGGERE DALL’ESPOSIZIONE PROLUNGATA ALLA

LUCE

contiene 3 controlli (1-ttivi intervalli di conc

ono indicati sull’etichetta di ogni fiala di controllo. I controlli sono trattati allo tesso modo dei campioni ottenuti da pazienti.

I

micropiastra. Il tamutilizzare per l’anal

campione o di controllo al pozzetto appropriato e si lascia incubare la piastra per 45 minuti a 20-26° C. Successivamente, i pozzetti vengono lavati con tamponelavaggio per rimuovere gli antigeni che non si sono legati in maniera specifica all’anticorpo immobilizzato. Ad ogni pozzetto viene aggiunto un anticorpo monoclonale anti-MPO marcon l’enzima HRP (perossidasi) e si lascia quin

20-26° C. Questo anticorpo coniugato si lega

presente nella fase solida e l’anticorpo coniugato. La piastra viene nuovamlavata con il tampone di lavaggio per rimuovere l’anticorpo marcato con HRP che non si è legato. Il substrato, rappresentato dal cromogeno tetrametilbenzidina (TMB), viene quindi aggiunto ad ogni pozzetto e lasciato incubare per 15 minuti a 20-26° C. Al termine dell’incubazione si svilupperà un colore blu. La reazione colorimetrica viene arrestata con l’aggiunta della soluzione bloccante che provoca il viraggio

Il “turnover” enzimatico del substrato viene determinato mediante analisi spettrofotometrica a 450 nm, preferibilmente con correzione a 630 nm, ed è direttamente proporzionale alla concentrazione di MPO. I valori di assorcalibratori vengono utilizzati per costruire il grafico di una curva di calibrazione dell’assorbanza rispetto alla concentrazione di MPO, con cui sarà possibile determinare la concentrazione dell’enzima nei controlli e nei campioni. REAGENTI E MATERIALI Materiale fornito con il kit:

Micropiastra rivestita Micropiastra rivestita con un anticorp

MPO, 12 strisce X 8 pozzetti. Tampone del test, 100 ml Soluzione salina tamponata con citrato, contenente detergenti ed additivi. Anticorpo coniugato anti-MPO, 13 ml, colore giallo Soluzione di

specifico per MPO coniugato a HRP. Reagente substrato TMB, 13 ml Soluzione contenente 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di

71

Soluzione bloccante, 13 ml Soluzione di acido solforico (0,4N) in acqua. Conservare questa soluzione tappandola ermeticamente. ATTENZIONE: IRRITANTE. Tampone di lavaggio concentrato 25X, 40 ml

9601

MPO in tampone fosfato con proteine, detergenti e stabilizzatori. Fare

E: CONTIENE MATERIALE DI ORIGINE UMANA.

1) o distillata

capace di leggere a 450 nm, preferibilmente con

correzione at 630 nm

re le curve appropriate per calcolare la

o).

AVV

ere trattati come materiale

n accordo alle normative locali, statali e federali.

Soluzione salina tamponata con Tris, contenente detergenti. Sigillatore della piastra, 2 Sigillatore del sacchetto, 1 Materiale richiesto ma non fornito: Kit di calibrazione CardioMPO™, 5 livelli di MPO (A-E), 1,1 ml ciascuno Cat. numero

riferimento all’etichetta su ogni fiala di calibratore per le concentrazioni effettive. Kit di controllo CardioMPO™, 3 livelli di MPO (1-3), 0,5 ml ciascunoCat. numero 8601 MPO in plasma umano trattato con litio-eparina. Fare riferimento all’ etichetta su ogni fiala di controllo per le concentrazioni effettive. ATTENZION

MANEGGIARE COME MATERIALE CAPACE DI TRASMETTERE INFEZIONI. Pipettatori di precisione a canale singolo o multicanale, capaci di erogare volumi tra 10 μL e 1000 μL con puntali monouso in polipropilene Acqua deionizzata (tipo

Cilindri graduati Miscelatore tipo Vortex o equivalente Agitatore orbitale per micropiastra capace di raggiungere 500 rpm Tovaglioli di carta. Sistema di lavaggio automatico per micropiastre

Un lettore di micropiastra

Software capace di estrapola

concentrazione di MPO dalla densità ottica dei calibratori (facoltativ

Carta millimetrata per la rappresentazione grafica manuale di dati (facoltativa).

ERTENZE E PRECAUZIONI

Per uso diagnostico in vitro.

Solo per uso professionale.

Tutti i campioni si plasma devono ess

potenzialmente infettivo. Devono essere osservate le procedure per la corretta manipolazione e

eliminazione, i

72

Reagente substrato TMB contenente 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB).

la zona con

te un medico.

a contatto con

na con acqua e sapone. Se viene a contatto

la zona con abbondanti getti d’acqua e

o.

cropiastra.

ti

. 8601) Includere i controlli CardioMPO™ in ogni

n

CON

I kit non ancora aperti devono essere conservati in frigorifero (2-8° C) al

ra

non siccante

ati come indicato, i kit non ancora

ull'etichetta. Non

e presentano segni di scolorimento, torbidità, precipitati o

ontenenti litio-eparina

risul nti litio-eparina devono essere immediatamente posti

sepa

fuga

massimo di due ore dal momento del prelievo.5 Una volta separato, il plasma

iù di 8 ore. Se il saggio non potrà essere

C). È stato

™ nel plasma si mantengono stabili per 8

r viene completato entro 8 giorni o se il plasma

plasma

non te congelati e scongelati, dal momento che

ar o /

scon

Se viene a contatto con la pelle, sciacquare subito la zona con acqua e sapone. Se viene a contatto con gli occhi, sciacquare subito

abbondanti getti d’acqua e consultare immediatamen

Soluzione bloccante contenente acido solforico 0,4N. Se viene

la pelle, sciacquare subito la zo

con gli occhi, sciacquare subito

consultare immediatamente un medic

Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza. Non riutilizzare i pozzetti della mi

Non mescolare con componenti provenienti da altri lotti del kit di reagenCardioMPO™.

I controlli non vengono forniti con il kit ma è possibile acquistarli separatamente (Cat. N

seduta che analizza i campioni del paziente. Se i valori del controllo norientrano nei limiti accettabili, l'analisi deve essere ripetuta. SERVAZIONE DEI REAGENTI

momento del ricevimento e fino alla data di scadenza. Le strisce per micropiastutilizzate devono essere sigillate in un sacchetto di alluminio con es

e conservate a 2-8° C. Se vengono conservdi scadenza indicata s

aperti rimarranno stabili fino alla data utilizzare i reagenti ch

perdite.

RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI

I campioni ematici devono essere raccolti in provette c

utilizzando una tecnica sterile di prelievo venoso. I campioni devono essere mescolati accuratamente mediante inversione per garantire la precisione dei tati. I campioni contene

in ghiaccio oppure a 2-8° C e conservati a 2-8° C fino al momento della razione. Il plasma deve essere separato dalle cellule utilizzando una

procedura standard di separazione, mediante preferibilmente una centrirefrigerata. Le linee guida CLSI (precedentemente NCCLS) raccomandano un

deve rimanere a 20-26° C per non p

completato entro otto ore, il plasma deve essere refrigerato (2-8°osservato che i livelli di CardioMPO

gioni a 2-8° C. Se il saggio non

già separato deve essere conservato per oltre 8 giorni, quest’ultimo deve essere congelato ad una temperatura pari o inferiore ai -15° C. I campioni di devono essere ripetutamen

questo processo può causare il deterioramento dell’analita. I livelli di CdioMPO™ nel plasma si sono mostrati stabili dopo 2 cicli di congelamentgelamento. 73

PROCEDURA DEL SAGGIO Procedurali Note

rima dell’uso, portare i reagenti, i campioni i calibratori e i controlli a 1. P

t

2. Tm

3. Rimuovere dal sacchetto di alluminio la cornice di supporto delle strisce e il

n to la piastra a

t i striscia inutilizzata nel

sacchetto di alluminio contenente l’e

2

4. Utilizzare un n vo puntale in polipropilene per ogni reagente, calibratore,

5. ato.

6. gente

ozzetti non vi siano residui di tampone di

rniti in forma pronta all’uso. Per preparare la diluizione del tampone di

emperatura ambiente (20-26° C) per almeno 30 minuti. utti i campioni, i calibratori e i controlli devono essere accuratamente escolati mediante vortex. Evitare la formazione di schiuma.

umero richiesto di strisce rivestite dopo avere porta

emperatura ambiente (20-26° C). Riporre ognssiccante, risigillare e conservare a

-8° C. uo

controllo o campione per evitare contaminazioni. Tutti i calibratori, i controlli e i campioni devono essere analizzati in duplicPrima dell'aggiunta dell’anticorpo coniugato anti-MPO e del rea

substrato TMB, assicurarsi che nei plavaggio. La presenza di residui del tampone di lavaggio può causare

variazioni nei risultati del saggio. 7. Per garantire l’accuratezza della misurazione, i campioni, i calibratori e i controlli devono essere aggiunti in modo preciso. Pipettare con attenzione utilizzando soltanto dispositivi calibrati. 8. Tutti i componenti del kit, ad eccezione del tampone di lavaggio concentrato, sono fo

lavaggio seguire la seguente procedura.

Tampone di lavaggio diluito 1X Prima dell’uso, portare a temperatura ambiente (20-26° C ) il tampone di lavaggio concentrato. Preparare una diluizione 1X del tampone di lavaggio versando l'intero contenuto della bottiglia di tampone concentrato 25X in un cilindro pulito da un litro. Risciacquare accuratamente la bottiglia con acqdeionizzata tipo I per rimuovere il tampone residuo e per dissolvere i cristAggiungere il liquido proveniente dal risciacquo, diluire con acqua deionizzatatipo I, portando al volume finale di un litro e mescolare accuratamente. Se conservato a 2-8° C, il tampone di lavaggio diluito 1X è stabile fino a due mesiPreparazione della piastra

ua

alli.

.

1. Pipettare 100 μl di ciascun calibratore CardioMPO™ nel pozzetto approprall’interno della micropiastra rivestita. 2. Pipettare 90 μL di tampone del test nel pozzetto appropriato, riservato ai campioni o ai controlli, all’interno della micropiastra rivestita. 3. Pipettare 10 μl di campione o di controllo ben mescolato nel pozzetto appropriato.

iato

74

Incubazione dei campioni

1. Sigillare la piastra con il sigillatore di piastra fornito e incubare su un

re

Incubazione con l’anticorpo coniugato

agitatore per piastre impostato a 500 rpm per 45 minuti, a temperatura ambiente (20-26° C).

2. Al termine del periodo di incubazione, lavare per quattro volte i pozzetti della micropiastra con 400 μl di tampone di lavaggio diluito. Dopo l’ultimolavaggio, aspirare il contenuto dei pozzetti.

3. Dopo l’ultimo lavaggio, asciugare la piastra capovolgendola su tovaglioli di carta per eliminare tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti. Non lasciaseccare i pozzetti. Procedere immediatamente alla fase successiva.

2. e incubare su un

3.

o

pozzetti.

i

ente alla fase successiva.

1. Pipettare 100 μl di anticorpo coniugato anti-MPO in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra con il sigillatore di piastra fornito

agitatore per piastre impostato a 500 rpm per 45 minuti, a temperatura

ambiente (20-26° C). Al temine del periodo di incubazione, lavare per quattro volte i pozzetti della micropiastra con 400 μl di tampone di lavaggio diluito. Dopo l’ultimlavaggio, aspirare il contenuto dei

4. Dopo l’ultimo lavaggio, asciugare la piastra capovolgendola su tovaglioli dcarta per eliminare tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti. Non lasciare seccare i pozzetti. Procedere immediatam

Incubazione con il substrato e sviluppo del colore Pipettare 100 μl di reagente substrato TMB in ciascun pozzetto. 1.

er 15 minuti, a

6° C).

2. Incubare su un agitatore per piastre impostato a 500 rpm ptemperatura ambiente (20-2

Arresto della reazione e lettura 1. Bloccare la reazione aggiungendo 100 μl di soluzione bloccante in ciascpozzetto. 2. Ruotare delicatamente la piastra su una superficie piana per mescolarne il contenuto. Assicurarsi che il colore da blue sia virato completamente al gial3. Leggere la densità ottica a 450 nm usando un lettore per micropiastre. Si

un

lo.

raccomanda di eseguire la correzione per il fondo a 630 nm.

1. zando il software appropriato. Si

to alla

CALCOLO DEI RISULTATI Costruire una curva di calibrazione utiliz

raccomanda di utilizzare un “curve fit” a quattro parametri. Il calcolo manuale può essere eseguito riportando in grafico il valore medio di assorbanza ottenuto per ciascun calibratore sull’asse delle ordinate (y) rispet

concentrazione di MPO (pmol/L) sull’asse delle ascisse (x). 75

2. Utilizzando il valore medio di assorbanza di ogni campione e controllo,

anto, non sono necessari altri calcoli.

ello,

dei campioni.

tture

30 nm, sono mostrati sull’asse delle

ordinate rispetto alle co te sull’asse delle

d

Assorbanza media

determinare la corrispondente concentrazione di MPO in pmol/l dalla curva di calibrazione. Il livello di MPO assegnato a ciascun calibratore è stabilito in rapporto all’uso di un volume di 10 μl di campione (a una diluizione di 1:10 nella piastra), pert

3. I campioni che presentano livelli di MPO superiori al valore del calibratore a più alta concentrazione, possono essere riportati come superiori a quel livcioè > 8000 pmol/l. Non si consiglia un’ulteriore diluizione

ESEMPIO DI CURVA DI CALIBRAZIONE I risultati di una tipica curva di calibrazione ottenuta utilizzando le le

O.D. a 450 nm, con correzione a 6

ncentrazioni di MPO (pmol/L) mostraascisse. L’utilizzatore dovrebbe costruire una nuova curva di calibrazione a

ogni saggio. La seguente curva di calibrazione è fornita solo a scopo illustrativo.

Calibratore Livello di MPO (pmol/l) (O.D. a 450 nm, correzione a 630 nm) A 8020 2,630

B 3650 2,000 C 1580 1,108 D 490 0,346

E 0 0,031

Curva di calibrazione

00 8000 9000

Concentrazione (pmol/L)

O

2.5

2

1.5D

1

00.5010002000300040005000600070

3

76

LIMITI cedura Pro

Si potranno ottenere risultati affidabili e riproducibili quando si esegue procedura del saggio dopo avere pienamente compreso le istr

la

uzioni

nerà

rbanza falsamente alti o

ra cui gli errori tecnici o procedurali, possono interferire con il

saggio CardioMPO™ e potrebbero causare risult

Interpreta

contenute nell’inserto della confezione e in conformità con le norme di buona pratica di laboratorio. Le procedure di lavaggio sono critiche. Un lavaggio insufficiente determi

una scarsa precisione nelle letture e valori di assobassi.

Come con un qualunque altro sistema di analisi che impieghi anticorpi di origine animale, esiste la possibilità di interferenza da anticorpi eterofili, come gli anticorpi umani anti-immunoglobuline murine (HAMA), presenti nel campione, che nella lettura potrebbe causare valori falsamente alti o bassi. Altri fattori, t

ati erronei.

zione clinica I livelli di MPO devono essere interpretati unitamente a clinici e gli

altri esami diagnostici.

Questo saggio non è stato progettato per sostituire gli sici fattori di

rischio identificati per la malattia coronarica quali ECG, si, marcatori

di necrosi miocardica, ecc.

SI

oggetti di sesso maschile (n = 150) e femminile (n = 150), in una popolazione

di donatori apparentemente sana. È stato utilizzato uno schema per la rilevazione

dei valori aberranti e la trasformazione di Box-Cox, seguita da un metodo solido

di rilevazione dei dati aberranti, allo scopo di eliminare sette valori aberranti.6

Dal

momento che non vi era alcuna differenza significativa dei livelli di MPO in

rapporto al sesso, l’intervallo di riferimento è stato stimato considerando l’intera

popolazione, dopo avere effettuato la correzione per i valori aberranti.

I valori mediani di concentrazione di MPO dei soggetti in banca dati dopo

correzione era di 340 pmol/l e l’intervallo dei risultati era compreso tra 137 e

984 pmol/l. La distribuzione non parametrica dei livelli di mieloperossidasi in

questa popolazione normale ha prodotto un intervallo di riferimento al 95%

centrale a due code, corretto per evitare l’influenza dell’eliminazione dei valori

aberranti, pari a 156 – 734 pmol/l. Tuttavia, in questa applicazione, il limite

inferiore più appropriato dell’intervallo di riferimento al 95% a una coda, ancora

una volta corretto per eliminare l’influenza dell’eliminazione dei valori aberranti ,

è < 640 pmol/l.

i reperti

a

altri clas

anamne

VALORI ATTE

Con il saggio s

CardioMPO™, sono stati valutati campioni di plasma ottenuti da

77

CARATTERISTICHE DEL SAGGIO

Sensibilità

Il limite minimo di rilevazione, calcolato interpolando la media più due deviaziodard di 26 replicati del calibratore di MPO (E), 0 pmol/l, è pari a 14 pm. ni

stan ol/l di

MPO

Precisione del saggio

Larecisione generale e intra-seduta è stata determinata testando 6 campioni io-eparina contenenti concentrazioni di MPO

p

test di plasma trattato con lit

distribuite lungo l’intera gamma di calibrazione del saggio, secondo le linee guida

ti

in d

pias

in d

ecisione

d

Numero di % CV % CV intra-

EP5-A della CLSI (precedentemente NCCLS). Questi campioni sono stati saggiauplicato, utilizzando un unico lotto di reagenti e calibratori, in due diverse tre al giorno, per 20 giorni. È’ stata eseguita una nuova curva di calibrazione uplicato per ogni piastra. I risultati di questi studi di precisione sono riassunti

nelle seguenti tabelle. Tabella 4: Riassunto dei Risultati degli Studi di Pr

Denominazione Concentrazione di

el campione test MPO (pmol/l) replicati totale seduta P 307 80 10,2% 5,8% lasma con litio

eparina Campione 1 P

epa

lasma con litio rina Campione 2 610 80 5,8% 5,0% P

1285 76* 7,4% 5,7% lasma con litio

eparina Campione 3

Plasma con litio

eparina Campione 4 1459 80 8,9% 8,6%Plasma con litio eparina Campione 5 2745 80 9,0% 9,0% Plasma con litio eparina Campione 6 4758 80 8,7% 6,4% Media 8,3% 6,7% * I dati di 1 intera giornata sono stati esclusi dall’analisi per la presenza di

grossolane aberrazioni. 78

Linearità

Ai campioni di plasma con litio-eparina a cui erano stati aggiunti (“spiked”)

i nelle miscele, utilizzando la valutazione polinomiale di linearità

e guida EP6-A della CLSI (precedentemente NCCLS). Il

ato lineare nei campioni di plasma con litio-eparina

elevati livelli di MPO, sono stati mescolati con campioni puliti di plasma con bassi livelli di MPO per creare 9 concentrazioni di MPO che rientravano o superavano l’intervallo lineare atteso. È stata determinata la linearità dei valori di MPO misurat

raccomandata nelle linesaggio CardioMPO™ si è mostr

alle concentrazioni di MPO comprese tra 14 pmol/l e 9410 pmol/l, entro 60 pmol/l o al 6% di questo intervallo. Recupero nei campioni “spiked” Nove campioni di plasma con litio-eparina sono stati “spiked” con 497, 1456, e 2851 pmol/l di MPO ed è stato analizzato il loro recupero. Il recupero percentuale è stato calcolato dividendo la concentrazione media di MPO misurata nel campione “spiked" per la concentrazione attesa di MPO, dove la concentrazione

attesa M ne

m

l’ u

Recupero nei campioni diluiti

PO era la somma della concentrazione di MPO misurata nel campio MPO aggiunto al campione. Il recupero

pulito di plasma e la concentrazione dim

edio di MPO nei ca87% e il 117% con

pioni di plasma con litio-na media del 100,7%

eparina spiked era compreso tra .

Nove campioni di plasma con litio-eparina sono stati “spiked” con 2851 pmol/l di

te diluit :4 e 1:8 con il tampone del test. Il recupero

lcolato dividendo la concentrazione media di MPO nel

moltipli r il fattore di diluizione, edia

O nel campione non sottoposto a pre-diluizione. Il recupero

e 1:2 e 13% per i c oni di on lit

ero percentuale compreso tra il 107% e il 117%.

dioMPO™ è stato progettato tenendo conto degli effetti di

m resenza d i un campio i plasm o. Pr

diluizio campioni. I campioni che presentano i

MPO superiori al valore del calibratore a più alta c no

erò conto del fatto la concentrazione di MPO ottenuta

on questo tipo di misurazione sarà superiore di circa il 13% rispetto al suo

MPO e successivamenpe ca

i 1:2, 1

rcentuale è statocampione pre-diluito, coP

cato pe

per la m

della

ncentrazione di Mmedio di una diluizionepup

ra del 1

ampi

plasma c

io-

arina, con un recIl test PrognostiX Car

atrice legati alla psconsiglia un’ulteriore

i 10 μl dne dei

ne d

a uman

ognostiX livelli d

oncentraz

ione posso

essere

riportati come superiori a quel livello, cioè > 8000 pmol/l. Tuttavia, è possibile utilizzare nel saggio una diluizione 1:2, utilizzando provette da laboratorio inpolipropilene, tenendo p

cvalore reale.

79

Reattività crociata

ella

ina

lle

ol/l)

I possibili agenti che possono determinare una reazione crociata, mostrati nseguente tabella, sono stati analizzati in plasma contenente litio-eparina secondo le linee guida EP7-A del CLSI (precedentemente NCCLS). Tutte le proteine analizzate, quando sono state aggiunte ai campioni di plasma con litio-eparraggruppati, hanno mostrato una cross-reattività inferiore allo 0,007% aconcentrazioni più alte e una cross-reattività inferiore al 1,7% alle più basse concentrazioni esaminate. Sostanze analizzate Concentrazioni analizzate (nm

α-1 antitripsina, umana 1250, 125, 12,5

Proteina C-reattiva, umana 543, 54,3, 5,43

Lisozima, umano 4464, 446,4, 44,64 IgA, umane 417, 41,7, 4,17 Elastasi, umana 2500, 250, 25 Perossidasi eosinofila, umana 887, 88,7, 8,87 Lattoperossidasi, bovina 801, 80,1, 8,01 Lattoferrina, umana 781, 78,1, 7,81 COX1, ovine 893, 89,3, 8,93 COX2, umane 868, 86,8, 8,68

Perossidasi tiroidea, umana 595, 59,5, 5,95

Troponina I, umana 2155, 215,5, 21,55

80

Sostanze che interferiscono con il saggio

o

Sostanze analiz

Concentrazioni

analizzate

(nmol/l)

Le sostanze mostrate nella seguente tabella, quando sono state analizzate in campioni di in plasma contenenti 3000 pmol/L e 1000 pmol/L di MPO secondo le linee guida EP7-A del CLSI (precedentemente NCCLS), hanno mostrato di non interferire con il saggio fino alle concentrazioni indicate. Una distorsione ugualeinferiore al 10% non è stata considerata come interferenza.

zate

Commenti

Acido acetilsalicilico 600 Dose

tossica

Albumina 50000

Alta*

Amoxicillina 75 dose

3 volte superiore alla.

terapeutica

Bilirubina, coniu

gata 50 Alta* Bilirubina, non-coniugata 150

Alta*

Captopril 5 Dose

tossica

Ceruloplasmina 600

Alta

Colesterolo 1000

Alta*

DNA 16,7

Alta Fenofibrato 45 la dose

.

3 volte superiore al

terapeutica

Emoglobina 5000

Emolisi*

Eparina, litio 3000 U/l dose

3 volte superiore allaterapeutica. Idroclorotiazide 6 3 volte superiore alla dose

terapeutica.

Idrocortisone 0,69 Dose tossica

Ibuprofene 500 Dose tossica

Indometacina 36 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Isosorbide dinitrato 0,15 3 volte superiore alla dose

terapeutica.

Lovastatina 53 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Metotrexato 160 Dose terapeutica

Metoprololo 5 Dose tossica

Naprossene 500 4 volte superiore alla dose

terapeutica.

Niacina 0,5 5 volte superiore alla dose

terapeutica.

Nifedipina 0,4 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Acido salicilico 600 Dose tossica

Azide sodica 0,50% 5 volte superiore alla dose

terapeutica.

Trigliceridi 5000 Lipemia

* Alta concentrazione di sostanza che interferisce con il saggio secondo EP7-A del

CLSI (precedentemente NCCLS)

81

Anticorpi che interferiscono con il saggio

Venti campioni, che si sapeva contenere livelli elevati di HAMA o RF, sono statanalizzati per interferenza nel saggio CardioMPO

i

eri che oscillavano

dal 37% al 43%. Quindi, non sono stat

un’in iva caus da RF; tutta apparenti

di MP idotti in pr anticorpi anti-MPO p-

Effetto gancio

TM. Il recupero medio di MPO da questi campioni era del 100% mentre i singoli recuperi oscillavano dal 96% al 109%. Dieci campioni, che si sapeva contenere gli anticorpi anti-MPO p-ANCA, hanno mostrato un recupero medio del 40% con singoli recup

e osservate evidenze in favore di ata da HAMA o esenza di

terferenza significatO possono essere r

via, i livelli ANCA.

N dioMPO™, non vi sono evidenze di un effe oni

f PO, circa 100 volte eriori rispetto al lim o

d e e 600 volte s iori rispetto al livello mediano

r nei pazienti dello studio clini

S INICO

Per determinare l’efficacia del saggio ioMPO™ PrognostiX come predittore

del rischio di eventi avversi cardiaci maggiori, sono stati misurati i livelli di MPO in

5 i di plasma provenienti d anca che conservava i campioni di

pazienti inclusi in uno studio. Tale s stato con

eran ronto Soccorso en ore dall’in

toracic ti per progressio

miocardico, per necessità di un interv di rivascolarizzazi nto

chirurgico di bypass coronarico, intervento coronarico percu

cateterizzazione, in presenza di stenos periore al 70

coronarici principali) o decesso nei 6 mesi cessivi. I campioni analizzati c

s erano stati otten pazienti da tà

mediana di 64 anni. La diagnosi clinica tata stabilita

precedentemente descritto.7 L’incidenza venti cardiaci avversi maggiori è

stata valutata mediante interviste tele he di follow-up

Sono stati sviluppati modelli di regressione logistica m 8.0,

SAS Institute) per calcolare odds ratio e intervalli di confidenza al 95%. Le

covariate corrette erano età, sesso, ra troponina T

>0,03 ng/ml)7, proteina C-reattiva (<1 mg/l, 1-3 mg/l, >3 m

(≤ 7, abitudine al fumo, anamne

per ipertensione, per ipercolesterolem a mancanza di in ulle

c lcuni soggetto ha deter la riduzion

popolazione dello studio. Il rischio di MACE in tutti i pazienti, nel successivo

periodo di 30 giorni, aumentava con l’aumentare dei quartili dei livelli di

Anche un’analisi simile in pazienti che erano costantemente negativi per

troponina T (≤0,03 ng/ml) ha evidenziato un rischio significativamente più alto di

MACE nei pazienti con livelli plasmatici di MPO nei quartili più alti. Gli odds ratio

corretti e le percentuali relative ai pazienti che rientravano in un quartile con e

senza MACE dopo 30 giorni sono mostrati nei grafici e nelle tabelle che seguono.

el test Car

tto gancio a concentraziitsim

ino a 1 μmol/l di M

sup

e mas

ell’intervallo accettabil

uper

egistrato

co.

TUDIO CL

Card

60 campion

a una b

tudio era

dotto su pazienti che si nza del dol

o presentati al Po.

tro 24

sorgeore ne verso l’infarto

2 I partecipanti sono stati monitora

ento

one (interve

taneo o

i su

% in almeno due vasi

sucuti da

on il i 23 ai 96 anni, con un'e

aggio CardioMPO™

è s di e

secondo quanto

fonic

a 30 giorni e a 6 mesi.

ultivariati (SAS versione

zza ,

(≤0,03 ng/ml vs. g/l)2, CK-M

B si positiva per diabete,

8,8 ng/ml vs. >8,8 ng/ml)

ia . L

formazioni s

ovariate di a

minato

e delle dimensioni della

mieloperossidasi. 82

Rischio di MACE in tutti i pazienti

ni, tutti i pazienti (n=523).

MACE registrati dopo 30 gior

1Pa

0

2030405060708090100zienti nel Quartile (%)MACENo MACE 0<11511151-18791880-2953>2953MPO per Quartile (pmol/l)

MPO(pmol/l) <1151 1151-1879 1880-2953 >2953

Odds ratio 1,0 2,5 2,8 3,3

IC 95% NA 1,3-4,8 1,5-5,6 1,7- 6,4 valore P p = 0,007 p = 0,0021 p < 0,001 *In ogni analisi il primo quartile costituiva il gruppo di riferimento Rischio di MACE in tutti i pazienti persistentemente negativi petroponina T

r

T

MACE registrati dopo 30 giorni, pazienti negativi per Tn(n=304) MPO(pmol/l) <1151 1151-1879 1880-2953 >2953

Odds ratio 010 20 30<11511151-18791880-2953>2953MPO per Quartile (pmol/l)Pa

40 50 60 70 80 90 100zienti nel Quartile (%)MACENo MACE

1,0 3,4 4,1 6,9

IC 95% ND 1,2-9,4 1,5-11,4 2,5-19,2

Valore P p = 0,0194 p = 0,007 p < 0,001 *In ogni analisi il primo quartile costituiva il gruppo di riferimento Va notato che potrebbe essere opportuno utilizzare differenti punti di cut-off a seconda della diverse popolazioni cliniche.

83

BIBLIOGRAFIA

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n ML, et al. N Eng J Med 2003; 349: 1

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10

06

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R

ppresenta

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Te

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0

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EC REP

CardioMPO™ è un marchio in corso di registrazione di PrognostiX, Inc.

84

CardioMPO

zimatico

zienti i calibratori e i

escolati

l pozzetto appropriato

della micropiastra.

4. Pipettare 90 μl di tampone de pozzetti per i campioni o per i

re su

9. Sigillare e lasciare incubare per 45 minuti, ruotando la piastra a 500 rpm.

10. Lavare 4 volte con 400 μl di tampon per lavaggio diluito e tamponare su

carta assorbente per rimuovere il tampone in eccesso.

11. Aggiungere 100 μl di reagente substrato TMB in ciascun pozzetto.

12. Incubare per 15 minuti, ruotando la piastra a 500 rpm.

13. Aggiungere 100 μl zion ascun pozzetto, e ruotare

delicatamente per mescolar

14. Leggere a 4

Mappa per micropiastra ra ioMPOPROGNOSTIX

Potrebbe essere necessario po i controlli in modo

differente in base al numero d

1 2 3 8 9 10 11 12

Kit di reagenti per saggio immunoen

Numero di catalogo: 7501

Guida di riferimento rapido per CardioMPOPROGNOSTIX

1. Prima dell’uso, portare i reagenti, i campioni dei pa

controlli a temperatura ambiente (20-26° C) per almeno 30 minuti.

2. Tutti i campioni, i calibratori e i controlli devono essere m

accuratamente mediante vortex. 3. Pipettare 100 μl di ciascun calibratore CardioMPO™ ne

l test in tutti i

controlli della micropiastra. 5. Pipettare 10 μl di campione del paziente o di controllo CardioMPO™ nell’appropriato pozzetto della micropiastra. 6. Sigillare e lasciare incubare per 45 minuti, ruotando la piastra a 500 rpm.7. Lavare 4 volte con 400 μl di tampone per lavaggio diluito e tamponacarta assorbente per rimuovere il tampone in eccesso. 8. Pipettare 100 μl di anticorpo coniugato anti-MPO (giallo) in ciascun pozzetto.

e

e bloccante a ci

di solu

e.

50 nm, preferibilmente con correzione a 630 nm

ccomandata da Card

sizionare i calibratori e

i campioni analizzati.

4 7

5 6 A CAL A 2 6 9

13 17 20 24 28 CTL3 35 39

B CAL B 3 7 1

0 14 18 21 25 29 CTL3 36 40

C CAL C 3 CTL1 10

14 18 21 25 29 32 36 40

D CAL D 4 CTL1

11 15 19 22 26 30 33 37 CAL A

E CAL E 4 7

11 15 19 22 26 30 33 37 CAL B

F 1 5 8 12 16 20 23 27 31 34 38 CAL C

G 1 5 8 12 16

CTL2 23 27 31 34 38 CAL D

H 2 6 9 13 17 CTL2 24 28 32 35 39 CAL E

85

SYMBOLS KEY / CLAVE DE LOS E DES SYMBOLES /

SYMBOLSCHÜSSEL / SPIEGAZ

/SIMBOLO

SÍMBOLOS / LÉGENDIONE DEI SIMBOLI:

SYMBOL / SÍMBOLO / SYMBOLE / SYMBOL DESCRIPTION / DESCRIPCIÓN / DESCRIPTION /BESCHREIBUNG / DESCRIZIONE

Manufactured By / Fabricado por / Fabriqué par / Hergestellt von /

Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por

Authorized Representative / Representante autorizautorisé / Autorisierter Vertreter / Rappresentante

ado / Représentant

autorizzato

In Vitro Diagnostic Medical Device / Producto sanitario para

ostic in

ivo

diagnóstico médico in vitroVitro / Appareil médical de diagnvitro / In-vitro diagnostisches medizinisches Gerät / Dispositdiagnost

ico medicale per uso in vitro e / Code de lot / Chargenbezeichnung / Batch Code / Código de lot

Codice di lotto

Expiration Date in Year-Month-Day Format / Fecha de caducidad en

formato de año-mes-día / Date de péremption en format An-Mois-Jour

cata come

/ Verfallsdatum im Format JJ-MM-TT / Data di scadenza indiAnno-Mese-Giorno peratura / Limite de

Temperature Limitation / Límite de tem

température / Temperaturbegrenzung / Limiti di temperatura

CE Mark / Marca CE / Marque CE / CE-Zeichen / Marchio CE

Consult Instructions For Use / Consulte las instrucciones de usung beac

so / Voir

hten /

le mode d’emploi pour l’utilisation / GebrauchsanweiConsultare le Istruzioni per l’uso

Catalog Number / Número de catálogo / Numéro de catalogue /

Katalognummer / Numero di catalogo

Pro t Fr igh otéj e / à e la lumière

Vo t ütz bew n eg da

tec

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t / Pr

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la luz

Tenir

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/

r Lich

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Warning: Contain an rc er dve cia: ien

material de origen ti nt iel

d’ e ine / Achtun th a n h nen ru

/ Avverte Con ma e di origine uman

s Hum

Sou

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humano / Aver

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nt : Coterialie

ient du matéruma

origin

huma

g: En

Ursp

ngs

nze:

tiene

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a Cauti / Precauci e / Mise en garde : Irritant /

Vo t: nd zi Ir e

on: Irrirsich

tantReize

ón: Irrione:

tantritant

/ AttenEC REP IVD YYYY/MM/DD REF

LOT 8°C

2°C

86

SYMBOL / DESCRIPT

SÍMBOLO / SYMBOLE / SYMBOL /SIMBOLO

ION / DESCRIPCIÓN / DESCRIPTION / BESCHREIBUNG / DESCRIZIONE

Enzyme Immunoassay / Inmunoanálisis enzimático / Dosage immunoenzymatique / Enzym-Immunoassay / Saggio immunoenzimatico

Reagent / Reactivo / Réactif / Reagenz / Reagente

Kit / Equipo / Kit/ Kit / Kit

est

RGNT

KIT

EIA Assay Buffer / Solución amortiguadora de análisis / Tampon de dosage / Assaypuffer / Tampone del t

Anti-MPO Antibody Conjugate / Conjugado de anticuerpo anti-MPO Conjugué d’anti

/

corps anti-MPO / Anti-MPO Antikörperkonjugat /

Anticorpo coniugato anti-MPO

Stop Solution / Solución de parada / Solution d’arrêt / Stop-Lösung / Soluzione bloccante

BUF

AB

ent / Reactivo de sustrato TMB / Réactif de

substrat TMB / TMB-Substratreagenz / Reagente substrato TMB

STOP TMB Substrate Reag

oplaca

de titulación, recubierta con anticuerpo anti-MPO, 96 pocillos /

Microplaque enduite d’anticorps anti-MPO, 96 puits / Mit Anti-MPOiastra

rivestita con anticorpi anti-MPO, 96 pozzetti

Microtiter plate coated with Anti-MPO Antibody, 96 wells / Micr

Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte, 96 Kavitäten / Microp

Plate sealer / Sellador de placas / Feuille scellante pour plaque / Plattenversiegler / Sigillatore di piastra

ncentrado de solución

)

25X

25X Wash Buffer Concentrate / Co

amortiguadora de lavado 25X / Concentré de tampon de lavage (25 X/ 25X Waschpufferkonzentrat / Tampone di lavaggio concentrato Contents / Contenido / Contenu / Inhalt / Contenuto

Calibrator / Calibrador / Calibrateur / Kalibrator / Calibratore

Control / Control / Contrôle / Kontrolle / Controllo

Concentration / Concentración / Concentration / Konzentration/ Concentrazione

TMB

PL

ATE

SEAL WASH

CONT

C L

CAL ONTROCONC 87

13575 30043

3/06

88